[發明專利]短須庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法

在審

• 申請號: 201910177998.5
• 申請日: 2019-03-08
• 公開（公告）號: CN109810982A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 鄭愛萍;楊美瓊;林妙端;陳敏
• 申請（專利權）人: 福建國際旅行衛生保健中心（福建出入境檢驗檢疫局口岸門診部）
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/11;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙) 11613
• 代理人: 蔡曉敏

本發明涉及昆蟲鑒定領域，具體涉及短須庫蠓特異基因及其分子鑒定方法。所述特異性基因為CO Ⅰ基因、Cyt b基因中的一種或兩種的組合，所述CO Ⅰ基因的序列為SEQ ID NO.1，所述Cyt b基因序列為SEQ ID NO.2，可用于短須庫蠓物種的準確鑒定。本發明提供一種準確率高、鑒定時間短的，將CO Ⅰ基因和Cyt b基因結合的短須庫蠓分子鑒定方法。將待測的昆蟲DNA分別與短須庫蠓的CO Ⅰ基因和Cyt b基因同源性比對，當同源性均達到98％以上，則判斷為待測的昆蟲為短須庫蠓。

技術領域

本發明涉及昆蟲鑒定領域，具體涉及短須庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法。

背景技術

庫蠓在動物分類上屬節肢動物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)雙翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)庫蠓屬(Culicoides)，是蠓科中最大的一個屬，也是吸血蠓屬中分布最廣，種類最多，與人畜關系最密切的一個屬，是多種重要動物蟲媒病的傳播媒介。近年來，隨著全球氣候變暖，在一定程度上使庫蠓傳播蟲媒病病毒的能力提高，也使庫蠓的分布范圍向地球兩極和高海拔地區擴大，庫蠓種群傳播蟲媒病毒給動物的能力增強，一些傳統的“非媒介”庫蠓種類具備了傳播疫病的能力。由庫蠓傳播的蟲媒病如藍舌病、水泡性口炎等，在全球一些國家或地區的傳播流行，造成了巨大的經濟損失，對畜牧業發展構成了嚴重威脅。短須庫蠓(Culicolides brevipalpis)屬庫蠓屬的二囊亞屬，在我國分布于福建、海南、廣東、云南、臺灣等地。

對吸血蠓的鑒定和識別，是監測與控制蠓傳疾病發生的基礎，也是疾病預防與控制領域的核心步驟。目前，對吸血蠓的鑒定主要依靠經驗豐富的分類學專家識別形態學特征來實現，一旦遇到近緣種和形態特征掌握不全的標本鑒定就很棘手；而且，對吸血蠓的形態鑒定需要通過制作玻片標本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、難度大，因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。

隨著分子生物學和生物信息學的快速發展，以DNA序列分析為依據的分子鑒定已成為物種鑒定的常用手段，極大地彌補了傳統分類鑒定的不足。線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)具有結構簡單，序列和組成一般比較保守，易于操作，母系遺傳，單拷貝，進化速率較核DNA快等特點，已被作為分子標記廣泛用于昆蟲分類學研究中。線粒體基因組中存在的13個蛋白編碼基因中僅細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome Oxidase SubunitⅠ，COⅠ)、線粒體細胞色素b(Cyt b)、ND4、ND5這4個基因滿足基因插入和缺失現象較少、長度在900bp左右這兩個條件，但ND4和ND5進化太快，不可能設計出通用引物，限制了它們作為全面DNA鑒定系統的目標基因。由于COⅠ基因在能夠保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增，而且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少數也主要分布于該基因的3端，對結果的分析不會造成很大的影響)。同時，它還擁有蛋白編碼基因所共有的特征，即密碼子第三位堿基不受自然選擇壓力的影響，可以自由變異，故人們選定COⅠ基因中的一個片段作為DNA條形編碼基因。但COⅠ基因作為物種鑒定的唯一目的基因尚存在不足，比如可能會存在雜交或者基因滲透，因此需要嘗試多個分子標記的結合使用。

目前，有文獻報道嘗試將COⅠ和ITS2兩個基因作為分子標記對吸血蠓進行鑒定，但ITS變異速度快，種內基因變異大，而且ITS基因序列無法直接測序，只能通過克隆獲得，采用其進行組合鑒定在很大程度上影響了鑒定的時效。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了解決現有技術的上述問題，本發明提供短須庫蠓的特異基因，能夠用于短須庫蠓物種的準確鑒定。

相應地，本發明提供一種準確率高、鑒定時間短的，將COⅠ基因和Cyt b基因結合的短須庫蠓分子鑒定方法。

(二)技術方案

為了達到上述目的，本發明采用的主要技術方案包括：