[發明專利]銀杏內生真菌代謝產物及在制備抑菌劑中的應用

有效

• 申請號: 201910174869.0
• 申請日: 2019-03-08
• 公開（公告）號: CN110066830B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 楊勝利;潘蕓;張慧;邵澤輝;楊錫;陳萍
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;A61K36/06;A61P31/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種銀杏內生真菌代謝產物及在制備抑菌劑中的應用，所述代謝產物由黃蓋小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY?F1發酵液經超聲、微濾、硅膠柱層析、凝膠Sephadex LH?20柱分離、半制備液相分離制備得到。所述銀杏內生真菌代謝產物對金黃色葡萄球菌MIC＝6.25mg/mL。天然成分的抑菌劑，安全性高。

(一)技術領域

本發明涉及一種金黃色葡萄球菌抑菌劑，具體涉及一種內生真菌代謝產物及在制備抗金黃色葡萄球菌藥物的應用。

(二)背景技術

植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌或細菌，包括內生真菌和內生細菌。近年來，國內陸續報道了從多種藥用植物中已分離獲得了產生多種藥理活性物質的內生菌。銀杏作為一種古老的藥用植物，素有“活化石”之稱，其具有抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性。目前，銀杏等其他物種資源都非常匱乏，如果大量地采伐又涉及到生態和環境等領域的問題。因此，尋找一種可以高效低耗地開發利用天然藥物的方法日益重要藥用植物內生菌也因此成為研究熱點。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種銀杏內生真菌代謝產物及在制備抑菌劑中的應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種銀杏內生真菌代謝產物，所述代謝產物按如下方法制備：(1)將黃蓋小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1發酵液經超聲破碎后抽濾，濾液經微孔濾膜過濾后用乙酸乙酯萃取，有機相濃縮至干，獲得代謝粗產物；所述黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2019125，保藏日期為2019年3月6日，地址為中國武漢武漢大學，郵編430072；(2)將步驟(1)代謝粗產物用乙酸乙酯溶解后進行硅膠柱層析，以體積比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集體積比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，濃縮至干，記為樣品Gf.11；(3)將步驟(2)樣品Gf.11用乙酸乙酯溶解后再次進行硅膠柱層析，以體積比60:1→0:1的氯甲烷-甲醇為流動相梯度洗脫，收集體積比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，濃縮至干，記為組分Gf.11-8；(4)組分Gf.11-8以體積比1:1的二氯甲烷：甲醇為洗脫劑進行凝膠Sephadex LH-20柱分離，收集第1至第4個柱體積的流出液，濃縮至0.05倍體積，獲得濃縮液；(5)將步驟(4)濃縮液用半制備液相分離，以體積比80:20的乙腈：水為流動相，流速為3mL/min，收集第3-4分鐘所出的單峰，濃縮至干燥，得銀杏內生真菌代謝產物。

進一步，步驟(1)發酵液制備方法為：將黃蓋小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1接種于發酵培養基中，28℃，180r/min培養7d，獲得發酵液；所述發酵培養基組成：硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，蔗糖30g/L，溶劑為蒸餾水，pH7.0～7.2。

進一步，步驟(1)代謝粗產物制備方法為：在405W條件下，每工作3s，間歇4s，進行300次循環對發酵液進超聲破壁處理后抽濾，取濾液經0.45μm微孔濾膜過濾后濃縮至原體積的1/3，用乙酸乙酯萃取，有機相濃縮至恒重，獲得黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1代謝粗產物。

進一步，步驟(2)按如下操作進行：將步驟(1)黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1代謝粗產物用乙酸乙酯溶解，加入硅膠，研磨均勻后，真空干燥，即為吸附樣品的硅膠；將吸附樣品的硅膠上樣于硅膠色譜柱中，裝柱量3/4，采用體積比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集體積比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，濃縮至干，記為樣品Gf.11；所述硅膠與代謝粗產物質量比為1.5：1。

進一步，步驟(2)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫體積比依次為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100。