[發明專利]銀杏內生真菌代謝產物及在制備抑菌劑中的應用

有效

• 申請號: 201910174869.0
• 申請日: 2019-03-08
• 公開（公告）號: CN110066830B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 楊勝利;潘蕓;張慧;邵澤輝;楊錫;陳萍
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;A61K36/06;A61P31/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于所述代謝產物按如下方法制備：(1)將黃蓋小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1發酵液經超聲破碎后抽濾，濾液經微孔濾膜過濾后用乙酸乙酯萃取，有機相濃縮至干，獲得代謝粗產物；所述黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2019125，保藏日期為2019年3月6日，地址為中國武漢武漢大學，郵編430072；(2)將步驟(1)代謝粗產物用乙酸乙酯溶解后進行硅膠柱層析，以體積比依次為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集體積比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，濃縮至干，記為樣品Gf.11；(3)將步驟(2)樣品Gf.11用乙酸乙酯溶解后再次進行硅膠柱層析，以體積比60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:1的氯甲烷-甲醇為流動相梯度洗脫，收集體積比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，濃縮至干，記為組分Gf.11-8；(4)組分Gf.11-8以體積比1:1的二氯甲烷∶甲醇為洗脫劑進行凝膠Sephadex LH-20柱分離，收集第1至第4個柱體積的流出液，濃縮至0.05倍體積，獲得濃縮液；(5)將步驟(4)濃縮液用半制備液相分離，采用ODS柱，以體積比80:20的乙腈∶水為流動相，流速為3mL/min，收集第3-4分鐘所出的單峰，濃縮至干燥，得銀杏內生真菌代謝產物；所述ODS柱型號以及參數：Luna、5μm、C18(2)、100A、250×10mm。

2.如權利要求1所述銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于步驟(1)發酵液制備方法為：將黃蓋小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1接種于發酵培養基中，28℃，180r/min培養7d，獲得發酵液；所述發酵培養基組成：硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，蔗糖30g/L，溶劑為蒸餾水，pH7.0～7.2。

3.如權利要求1所述銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于步驟(1)代謝粗產物制備方法為：在405W條件下，每工作3s，間歇4s，進行300次循環對發酵液進超聲破壁處理后抽濾，取濾液經0.45μm微孔濾膜過濾后濃縮至原體積的1/3，用乙酸乙酯萃取，有機相濃縮至恒重，獲得黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1代謝粗產物。

4.如權利要求1所述銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于步驟(2)按如下操作進行：將步驟(1)黃蓋小脆柄菇Gb.PY-F1代謝粗產物用乙酸乙酯溶解，加入硅膠，研磨均勻后，真空干燥，即為吸附樣品的硅膠；將吸附樣品的硅膠上樣于硅膠色譜柱中，裝柱量3/4，采用體積比依次為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集體積比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，濃縮至干，記為樣品Gf.11。

5.如權利要求4所述銀杏內生真菌代謝產物，其特征在于所述硅膠與代謝粗產物質量比為1.5∶1。

6.如權利要求1所述銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于步驟(3)按如下操作進行將步驟(2)樣品Gf.11用乙酸乙酯溶解，加入硅膠，研磨均勻后，真空干燥，即為吸附樣品Gf.11的硅膠，將吸附樣品Gf.11的硅膠上樣于硅膠色譜柱中，裝柱量3/4，以體積比60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:1的氯甲烷-甲醇為流動相梯度洗脫，收集體積比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，濃縮至干，記為組分Gf.11-8；所述硅膠與樣品Gf.11質量比為1.5∶1。

7.如權利要求1所述銀杏內生真菌代謝產物的制備方法，其特征在于步驟(5)按如下操作進行：將步驟(4)濃縮液用半制備液相分離，采用ODS柱，以體積比80:20的乙腈∶水為流動相，流速為3mL/min，柱溫25℃，進樣量每次為0.5mL，收集第3-4分鐘所出的單峰，濃縮至干燥，得銀杏內生真菌代謝產物。