[發明專利]一種C反應蛋白的濃度檢測方法

在審

• 申請號: 201910168784.1
• 申請日: 2019-03-06
• 公開（公告）號: CN109782000A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 孫樹清;趙原芳;吳振杰;沙洲;譚英
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

本發明公開了一種C反應蛋白的濃度檢測方法，包括S1、搭建具有三明治結構的金納米顆粒?核酸適配體?磁球生物傳感器；S2、將待測C反應蛋白投入到生物傳感器的緩沖液中進行反應，使C反應蛋白將生物傳感器上的金納米顆粒置換到緩沖液中；S3、反應結束后，提取緩沖液中的金納米顆粒在暗場顯微鏡下觀察并計數；S4、根據預先得到的C反應蛋白濃度與金納米顆粒數量的對應關系，得到待測C反應蛋白的濃度；其中，該對應關系通過如下方式得到：利用多組已知濃度的C反應蛋白樣品分別與生物傳感器形成多個實驗組進行反應后，對每組分別執行S3，并采用數值擬合方法對C反應蛋白樣品的濃度與對應的置換下來的金納米顆粒數量進行曲線擬合，得到該對應關系。

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，尤其是涉及生物傳感器構建及其應用領域，具體涉及一種C反應蛋白的濃度檢測方法。

背景技術

暗場顯微鏡技術是利用斜射照明法阻擋透過標本細節的直射光，以反射光和衍射光來觀察標本，普通顯微鏡下可以看到0.45um的細節，而暗場顯微鏡下能看到0.2～0.004um的極微小物體。金納米顆粒易于制備，無毒性，具有良好的生物相容性，其包括金納米球、金納米棒、金納米片等形式，可應用于生物檢測方面，其強散射特性會隨著尺寸形貌的不同發生極大變化，利用這種特性可以在暗場顯微鏡下特異性地識別特定尺寸特定形貌的金納米顆粒。

核酸適配體是指利用指數富集進化技術(SELEX)從特定的寡核苷酸庫中篩選出能與靶分子特異性結合的寡核苷酸單鏈。核酸適配體的首次體外篩選是由Tuerk等在1990年建立的體外寡核苷酸篩選，從帶有8個隨機序列的RNA文庫中篩選出和噬菌體T4DNA聚合酶特異性結合的核酸序列。此后，核酸適配體已成熟發展為新一代靶分子特異性識別結合體，可以是單鏈DNA，也可以是RNA，一般由幾十個核苷酸(20～80nt)組成。與蛋白質靶標結合的核酸適配體通過自身折疊形成的二、三級結構，如莖、凸環、發夾、G-四聯體、假結體和四角環等，能夠與蛋白質靶標的空間結構相匹配，實現高親和力、高特異性的結合。

人類C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)是指在機體受到感染或組織損傷時血漿中一些急劇上升的蛋白質(急性蛋白)。CRP是炎癥和心血管疾病的警示因子，故CRP的檢測在體外活檢領域也受到了越來越多的重視。目前CRP的檢測方法主要有免疫比濁法、散射法、免疫分析法等，這些方法樣品前處理比較復雜、操作過程繁瑣費時，有的需要大型儀器且價格昂貴。另有一些文獻提到基于核酸適配體的檢測方法，可提升測試體系的靈敏性和特異性，同時可降低被檢物的檢測下限，但這些方法仍存在一定的缺陷：一方面，通常要讓核酸適配體和抗體聯用，但抗體具有需體內篩選、穩定性較差、易于失活等缺點，這便會大大增加檢測成本以及測試過程和結果的不穩定性；另一方面，這些文獻中提到的單獨采用核酸適配體檢測的方案，其所使用的為RNA核酸適配體，RNA易于失活降解，不易于實際檢測。即便有的文獻提到采用DNA核酸適配體，但其檢測所使用的儀器也較為昂貴，并且樣品預處理較為復雜，操作過程繁瑣。

以上背景技術內容的公開僅用于輔助理解本發明的發明構思及技術方案，其并不必然屬于本專利申請的現有技術，在沒有明確的證據表明上述內容在本專利申請的申請日前已經公開的情況下，上述背景技術不應當用于評價本申請的新穎性和創造性。

發明內容

本發明的主要目的在于克服現有技術的不足，提出一種C反應蛋白的濃度檢測方法，通過采用核酸適配體搭建一個操作便捷、靈敏度高的生物傳感器來檢測C反應蛋白，提高了檢測方法靈敏度和特異性的同時，降低了檢測成本以及待檢物的檢測下限。

本發明為達上述目的提出以下技術方案：