[發明專利]一種C反應蛋白的濃度檢測方法

在審

• 申請號: 201910168784.1
• 申請日: 2019-03-06
• 公開（公告）號: CN109782000A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 孫樹清;趙原芳;吳振杰;沙洲;譚英
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

1.一種C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、搭建具有三明治結構的金納米顆粒-核酸適配體-磁球生物傳感器；

S2、將待測C反應蛋白投入到含有所述生物傳感器的緩沖液中進行反應，以使C反應蛋白將所述生物傳感器上的金納米顆粒置換到緩沖液中；

S3、反應結束后，提取緩沖液中的金納米顆粒在暗場顯微鏡下觀察并計數；

S4、根據預先得到的C反應蛋白濃度與金納米顆粒數量的對應關系，得到待測C反應蛋白的濃度；

其中，所述對應關系通過如下方式得到：利用多組已知濃度的C反應蛋白樣品分別與所述生物傳感器形成多個實驗組進行反應后，對每組分別執行步驟S3，并采用數值擬合方法對C反應蛋白樣品的濃度與對應的置換下來的金納米顆粒數量進行曲線擬合，得到所述對應關系。

2.如權利要求1所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，步驟S1具體包括：

S11、用DNA修飾金納米顆粒：讓修飾有巰基的c-DNA與金納米顆粒通過金巰鍵的相互作用連接；

S12、用DNA修飾磁球：讓核酸適配體與磁球通過生物素與親和素的非共價相互作用連接；其中，所述核酸適配體是修飾有生物素的C反應蛋白核酸適配體，所述磁球是修飾有鏈霉親和素的磁球；

S13、將經過步驟S11和S12修飾后的金納米顆粒和磁球通過堿基互補配對作用連接，形成所述具有三明治結構的金納米顆粒-核酸適配體-磁球生物傳感器。

3.如權利要求2所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，步驟S12中所述C反應蛋白核酸適配體為5'-CGAAGG GGA TTC GAG GGG TGA TTG CGT GCT CCATTT GGT G-3'，相匹配的所述c-DNA為5'-TTT TTT TTC ACC AA-3'。

4.如權利要求1所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，所述緩沖液包括10mMPBS、0.3M NaCl以及0.01wt％SDS。

5.如權利要求1所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，步驟S3具體包括：

反應結束后，提取游離于所述緩沖液中的金納米顆粒并置于載玻片上進行固定，在暗場顯微鏡下利用彩色CCD拍照獲得暗場圖像，從所述暗場圖像上對金納米顆粒進行計數，以統計被待測C反應蛋白置換出的金納米顆粒數量。

6.如權利要求5所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，步驟S3中采用磁分離液相技術提取金納米顆粒以進行所述計數。

7.如權利要求5所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，在MATLAB中利用所述暗場圖像對金納米顆粒進行計數。

8.如權利要求1所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，還包括采用若干組濃度已知的C反應蛋白作為驗證組，來驗證所述對應關系的準確性；所述驗證組的C反應蛋白的濃度與所述多個實驗組的C反應蛋白樣品濃度不同。

9.如權利要求1至8任一項所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，所述金納米顆粒包括金納米球和金納米棒。

10.如權利要求9所述的C反應蛋白的濃度檢測方法，其特征在于，所述金納米顆粒是尺寸35～75nm的金納米球，其在暗場顯微鏡下呈綠色。