[發(fā)明專利]一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910165784.6
• 申請(qǐng)日: 2019-03-05
• 公開（公告）號(hào): CN109913528A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旺;趙培雅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州昱鼎生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 常州易瑞智新專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32338
• 代理人: 徐琳淞

本發(fā)明公開了一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，包括以下步驟：步驟一：對(duì)PCA3DNA進(jìn)行合成；步驟二：PCR擴(kuò)增；步驟三：PCR產(chǎn)物純化；步驟四：體外轉(zhuǎn)錄得到RNA；步驟五：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化；步驟六：RNA標(biāo)準(zhǔn)品定量。通過本發(fā)明制備的PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，可作為陽性質(zhì)控品，也可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)待測(cè)品進(jìn)行基因拷貝數(shù)定量，并且靈敏度和特異性均較高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法。

背景技術(shù)

在我國現(xiàn)階段，前列腺癌篩查主要內(nèi)容如下：推薦對(duì)于50歲以上，或者是有前列腺癌家族史的45歲以上男性，在充分告知篩查風(fēng)險(xiǎn)的前提下，進(jìn)行以PSA(PSA檢測(cè))檢測(cè)為基礎(chǔ)的前列腺癌篩查，以期早期發(fā)現(xiàn)降低死亡率。PSA作為臨床上廣泛使用的前列腺癌標(biāo)志物，雖然能夠有效診斷部分前列腺癌患者，但良性前列腺增生、前列腺炎以及前列腺按摩、經(jīng)直腸超聲檢查等均會(huì)導(dǎo)致PSA水平異常升高，且有許多研究表明，當(dāng)PSA處于灰區(qū)即4～10ng/ml時(shí)，診斷率僅為25％。所以PSA的腫瘤特異性不高，學(xué)者們一直在尋找新的前列腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物。

其中長鏈非編碼RNA前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3，PCA3)：PCA3是一種在前列腺癌中表達(dá)的因子。已被美國FDA批準(zhǔn)作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。PCA3作為前列腺癌特異性基因，主要表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞中，而在正常組織、良性前列腺增生或其他組織腫瘤中則無表達(dá)或者極少表達(dá)。在PSA升高的患者中，使用尿液中PCA3作為診斷標(biāo)志物比使用PSA、血清游離PSA等更能提高前列腺癌的診斷準(zhǔn)確率。EAU指南也推薦在初始前列腺穿刺陰性，但仍懷疑前列腺癌的患者中進(jìn)行PCA3檢測(cè)。而傳統(tǒng)的前列腺穿刺活檢雖然靈敏度較高，但特異性較低，易出現(xiàn)不必要的陰性穿刺，故需要尋找一種能夠有效診斷前列腺癌的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，該方法制備的PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品可用于陽性質(zhì)控品，也可用于絕對(duì)定量測(cè)定尿液中PCA3含量。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，包括以下步驟：

步驟一：對(duì)PCA3DNA進(jìn)行合成；

步驟二：PCR擴(kuò)增；

步驟三：PCR產(chǎn)物純化；

步驟四：體外轉(zhuǎn)錄得到RNA；

步驟五：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化；

步驟六：RNA標(biāo)準(zhǔn)品定量。

所述步驟二中25ul反應(yīng)體系為：

所述步驟二具體包括以下步驟：

S1，將PCR反應(yīng)所需的成分配置完成后，在PCR儀上于95℃預(yù)加熱5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)；

S2，擴(kuò)增循環(huán)：在每一個(gè)循環(huán)中，先于95℃保持10s使模板變性，然后將溫度降到55℃保持10s，使引物與模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA,完成一個(gè)循環(huán)，重復(fù)此循環(huán)共進(jìn)行35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積；

S3，在72℃保持10min，使產(chǎn)物延伸完整，然后12℃環(huán)境下保存。

所述步驟三的具體步驟為：收集→上柱→洗滌→洗脫。

所述步驟四具體為：將T7酶混合液的組分振蕩混勻，短暫離心收集于管底，冰上儲(chǔ)存?zhèn)溆茫蝗缓笈渲品磻?yīng)體系，用移液器輕輕混勻各組分，并短暫離心收集，在PCR儀器中37℃孵育2小時(shí)。

所述步驟四配制的反應(yīng)體系為：