[發(fā)明專利]一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910165784.6
• 申請(qǐng)日: 2019-03-05
• 公開（公告）號(hào): CN109913528A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旺;趙培雅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州昱鼎生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 常州易瑞智新專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32338
• 代理人: 徐琳淞

1.一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：合成PCA3DNA；

步驟二：PCR擴(kuò)增；

步驟三：PCR產(chǎn)物純化；

步驟四：體外轉(zhuǎn)錄得到RNA；

步驟五：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化；

步驟六：RNA標(biāo)準(zhǔn)品定量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟二中25ul反應(yīng)體系為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟二具體包括以下步驟：

S1，將PCR反應(yīng)所需的成分配置完成后，在PCR儀上于95℃預(yù)加熱5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)；

S2，擴(kuò)增循環(huán)：在每一個(gè)循環(huán)中，先于95℃保持10s使模板變性，然后將溫度降到55℃保持10s，使引物與模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA,完成一個(gè)循環(huán)，重復(fù)此循環(huán)共進(jìn)行35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積；

S3，在72℃保持10min，使產(chǎn)物延伸完整，然后12℃環(huán)境下保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟三的具體步驟為：收集→上柱→洗滌→洗脫。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟四具體為：將T7酶混合液的組分振蕩混勻，短暫離心收集于管底，冰上儲(chǔ)存?zhèn)溆茫蝗缓笈渲品磻?yīng)體系，用移液器輕輕混勻各組分，并短暫離心收集，在PCR儀器中37℃孵育2小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟四配制的反應(yīng)體系為：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟五具體為：首先室溫解凍，然后加異丙醇沉淀RNA，然后加無水乙醇清洗3次，再干燥5-10分鐘，最后加無菌水溶解。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備PCA3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述步驟六具體為：通過Nanodrop微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，分裝保存在-80℃冰箱備用；然后對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。