[發明專利]一種利用TEF1啟動子調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶表達的重組畢赤酵母菌株及構建方法

在審

• 申請號: 201910162451.8
• 申請日: 2019-03-05
• 公開（公告）號: CN109749948A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 李洪波;張天琪;畢日秀;吳澤慧
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/10;C12R1/84
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明涉及一種利用TEF1啟動子調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，所述重組畢赤酵母菌株為將來源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase)基因轉入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，該重組畢赤酵母菌株是通過將pPIC9K質粒中的醇氧化酶啟動子P_AOX1替換成翻譯延伸因子1?α啟動子P_TEF1，并與谷氨酰胺轉氨酶基因連接成環，構成重組表達載體的方式得到的。本重組菌株易于培養、分泌能力強，利于谷氨酰胺轉氨酶的大量表達，酶活可達479mU/mL，具有安全可靠的特點，且具有重要的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其是一種利用TEF1啟動子調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶表達的重組畢赤酵母菌株及構建方法，更具體地為重組質粒pTEF9k-tgz的構建和通過啟動子P_TEF1調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶在巴斯德畢赤酵母中的表達。

背景技術

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一種催化酰基轉移反應的酶，它能催化谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(氨基受體)和賴氨酸殘基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供體)之間的酰基轉移反應。TGase的這種催化作用改變了蛋白質的構象，實現了蛋白質分子內、分子間的交聯，從而改善了蛋白質的功能性質。

TGase廣泛分布于動物、植物和微生物的機體組織中。20世紀50年代，豚鼠肝臟TGase(Guinea pig transglutaminase,GTG)是商業酶的主要來源，但其來源稀少、分離純化工藝復雜，導致酶的價格較高，使其在食品工業中的應用面臨一定的困難。隨后，研究者分離純化了微生物來源的TGase(MTG)，由于該酶可以利用微生物發酵法大規模生產，所以MTG最終實現了商業化生產。

與動物和微生物來源TGase相比，研究者對植物來源TGase的研究較少。植物TGase主要分布于植物的細胞質、細胞壁、葉綠體和線粒體等亞細胞區室，可能與植物組織中的能量轉移、細胞骨架形成有關。但是由于從植物組織中提取TGase的分離純化工藝復雜，產量較低，限制了其進一步的應用和研究。目前利用基因工程技術將黏玉米來源TGase(TGZ)基因在大腸桿菌、畢赤酵母等異源宿主中表達已成為新的趨勢。然而，總體來說構建的菌株產酶量低、穩定性差、生產成本較高，與商業化生產仍有一定的差距。因此，如何在表達體系中穩定、高效地直接表達活性谷氨酰胺轉氨酶，是當前植物來源谷氨酰胺轉氨酶研究的一個趨勢，對于該酶的應用研究具有重要意義。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種利用TEF1啟動子調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，該重組菌株易于培養、分泌能力強，利于谷氨酰胺轉氨酶的大量表達，酶活可達479mU/mL，利用畢赤酵母為宿主發酵得到的谷氨酰胺轉氨酶具有安全可靠的特點，且具有重要的應用前景。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種利用TEF1啟動子調控黏玉米谷氨酰胺轉氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，所述重組畢赤酵母菌株為將來源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase)基因轉入巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中得到的基因工程菌株，該重組畢赤酵母菌株是通過將pPIC9K質粒中的醇氧化酶啟動子P_AOX1替換成翻譯延伸因子1-α啟動子P_TEF1，并與谷氨酰胺轉氨酶基因連接成環，構成重組表達載體的方式得到的。

而且，所述谷氨酰胺轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

而且，所述P_TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。