[發(fā)明專利]一種利用TEF1啟動子調(diào)控黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達的重組畢赤酵母菌株及構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910162451.8
• 申請日: 2019-03-05
• 公開（公告）號: CN109749948A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李洪波;張?zhí)扃?/a>;畢日秀;吳澤慧
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/10;C12R1/84
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種利用TEF1啟動子調(diào)控黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，其特征在于：所述重組畢赤酵母菌株為將來源于黏玉米(Zea mays)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase)基因轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中得到的基因工程菌株，該重組畢赤酵母菌株是通過將pPIC9K質(zhì)粒中的醇氧化酶啟動子P_AOX1替換成翻譯延伸因子1-α啟動子P_TEF1，并與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因連接成環(huán)，構(gòu)成重組表達載體的方式得到的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用TEF1啟動子調(diào)控黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，其特征在于：所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用TEF1啟動子調(diào)控黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，其特征在于：所述P_TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的利用TEF1啟動子調(diào)控黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達的重組畢赤酵母菌株，其特征在于：所述重組畢赤酵母菌株的宿主為P.pastoris GS115。

5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟如下：

⑴獲得來源于黏玉米的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因與啟動子P_TEF1序列；

⑵將pPIC9K質(zhì)粒載體與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因連接，獲得含有黏玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的重組質(zhì)粒pAOX9k-tgz；

⑶啟動子P_TEF1進行Sac I和Bam HI雙酶切并定向插入同樣經(jīng)Sac I和Bam HI雙酶切的重組質(zhì)粒pAOX9k-tgz中，獲得重組載體pTEF9k-tgz；

⑷將步驟⑶得到的重組載體pTEF9k-tgz轉(zhuǎn)化到宿主中，獲得重組畢赤酵母菌株。

6.如權(quán)利要求1至4任一項所述的重組畢赤酵母菌株生產(chǎn)黏玉米來源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，其特征在于：步驟如下：

將重組畢赤酵母接種于YPD培養(yǎng)基中，25-30℃，210-260r/min活化培養(yǎng)20-27h后，得活化的培養(yǎng)液，再將活化的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵體系中，發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組畢赤酵母菌株生產(chǎn)黏玉米來源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，其特征在于：按10％的接種量將活化的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基中，每24h加入甘油，使其體積終濃度為2％，發(fā)酵時間為96h，即得谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。