[發明專利]一種優化的PCV2d ORF2基因及病毒樣顆粒的制備方法

在審

• 申請號: 201910161371.0
• 申請日: 2019-03-04
• 公開（公告）號: CN111647609A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 繆德年;夏葉;李春華;鄭琳琳;王宏華;黃冬;薄宗義;廖學文
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01;C07K16/08
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬于分子生物學領域，公開了一種優化的PCV2d ORF2基因及其病毒樣顆粒的制備方法。本發明對編碼豬圓環病毒2d亞型Cap蛋白的編碼基因序列優化后，構建表達工程菌表達系統進行Cap蛋白的表達。在適合的表達條件下，該表達菌可大量表達可溶且具有活性的豬圓環病毒2d亞型Cap蛋白，利用單克隆抗體柱對表達蛋白進行純化，得到高純度高濃度的Cap蛋白，且該蛋白可形成病毒樣顆粒。本發明實現了豬圓環病毒2d亞型全長Cap蛋白在原核表達系統中的高效可溶表達，操作簡單，成本低廉，制備的單克隆抗體柱能反復使用，純化得到的Cap蛋白具有高濃度和高純度，且能自發形成病毒樣顆粒，免疫原性好，適合工業化應用。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及利用優化的PCV2d ORF2基因和單克隆抗體柱純化得到可溶性PCV2d Cap蛋白及病毒樣顆粒的制備方法。

背景技術

豬圓環病毒2型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、增生性壞死肺炎等豬圓環病毒相關疾病的主要病原。目前，PCV2在中國乃至世界豬群中普遍存在，給養豬業造成嚴重經濟損失。豬一旦感染圓環病毒病，無有效藥物治療，因此疫苗免疫是預防本病的主要途徑。PCV2共有11個開放閱讀框(ORF)，其中ORF1和ORF2是最主要的兩個閱讀框。研究表明ORF2為編碼病毒的主要結構蛋白和衣殼蛋白(Cap)，Cap蛋白上的抗原表位具有免疫原性，是疫苗研制的基礎。

目前市場上的PCV2疫苗主要為滅活疫苗和亞單位疫苗。其中，滅活疫苗免疫效果差，需多次加強免疫才能達到預防效果，且滅活疫苗可因滅活過程不完全而導致安全性問題。亞單位疫苗均采用真核表達系統生產，然而由于ORF2編碼的Cap蛋白在真核表達系統中的表達量極低，即使利用高表達的桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，表達量通常也很難超過50-100mg/L(Pumpens P,Grens E.HBV core particles as a carrier for B cell/Tcell epitopes.Intervirology,2001,44:98–114.)，因此產量低、成本高，造成養殖場難以在生產中使用這類疫苗。

為了提高產量，利用大腸桿菌表達系統進行Cap蛋白的表達，但是通常只能得到不可溶形式的變性包涵體蛋白，需要通過蛋白復性才能得到可溶性蛋白，這種先變性再復性的方法對蛋白產量以及蛋白活性均具有一定損失(李中圣，王鳳求，伍建敏，等.一種豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的制備方法及通過該方法獲得的病毒樣顆粒：中國，CN201710439243.9[P]，2017.10.13.)。

PCV2可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d以及PCV2e等多個亞型。2004年前PCV2的流行毒株以PCV2a亞型為主，2004年后流行趨勢逐漸轉變為PCV2b亞型，且不斷有PCV2d 和PCV2e兩種新亞型的出現。2014年后，PCV2d亞型逐漸替代PCV2b亞型成為主導血清型 (徐妮.山東省豬圓環病毒病的血清學調查及PCV2分離株的遺傳變異分析[D].泰安,山東農業大學,2014；Xiao CT,Halbur PG,Opriessnig T.Global molecular genetic analysis ofporcine circovirus type 2(PCV2)sequences confirms the presence of four mainPCV2genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d[J].J Gen Virol, 2015,96:1830-1841)。目前的商品化疫苗，例如法國梅里亞公司的美國勃林格公司的CIRCOFLX^TM以及青島易邦生物工程有限公司的“易圓凈”等都是基于PCV2a或PCV2b亞型，尚未有基于PCV2d亞型的疫苗上市。鑒于目前我國由PCV2b亞型向PCV2d亞型轉變的流行態勢，開展基于PCV2d亞型疫苗的研究具有重要的意義。