[發明專利]一種人成纖維細胞生長因子18及其可溶性重組表達方法、制備方法、制劑和應用

有效

• 申請號: 201910154313.5
• 申請日: 2019-03-01
• 公開（公告）號: CN109836487B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 曾鑫;曹宇;覃曉蘭;蔡春淞;范玲玲;范開
• 申請（專利權）人: 重慶派金生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/50
• 分類號: C07K14/50;C12N15/70;C07K1/18;C07K1/22;A61K38/18;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 重慶中之信知識產權代理事務所(普通合伙) 50213
• 代理人: 袁慶民

本發明公開了一種人成纖維細胞生長因子18，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；這種N端缺失的人成纖維細胞生長因子18的可溶性重組表達方法，包括如下步驟：(1)選用含T7啟動子的質粒作為表達載體、對應的大腸桿菌作為宿主菌；(2)SEQ ID NO:1對應的cDNA的重組子以及表達菌株；(3)表達菌株誘導表達條件為：溫度15～30℃、乳糖或IPTG誘導、誘導培養時間4～16小時。這種N端缺失的人成纖維細胞生長因子18的制備方法，這種N端缺失的人成纖維細胞生長因子18的制劑，這種N端缺失的人成纖維細胞生長因子18用于治療骨關節炎或關節軟骨損傷。

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種人成纖維細胞生長因子18及其可溶性重組表達方法、制備方法、制劑和應用。

背景技術

成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)是一類由FGF基因家族成員編碼的結構相關的蛋白質，對內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等多種中胚層和神經外胚層來源的細胞有促進DNA合成和細胞分裂作用，主要由成纖維細胞、內皮細胞、骨細胞、惰性細胞分泌，相對分子量一般在17～34kD。成纖維細胞生長因子18(fibroblast growthfactor 18，以下簡稱FGF18)最早由日本科學家Ohbayashi在1998年首次從老鼠胚胎中分離得到，在骨骼生長發育過程中扮演著重要的角色。

文獻報道(Ornitz and Marie,GenesDevelopment,16:1446-1465(discussingthe role of all FGFs，including FGF18 in bone development)，FGF18具有廣泛的生理功能，對骨發育、胚胎發育、傷口愈合有影響。文獻(Ellsworth et al.,Osteoarthritisand Cartilage(2002)10,308-320；Ellsworth et al.Stroke(2003)34(6):1507-12)證明FGF18是軟骨細胞和成骨細胞的增值劑。研究發現FGF18通過調控FGFR、Twist1和BMP骨形態發生蛋白的表達參與整個生命活動過程。臨床上研究將FGF18應用于治療軟骨疾病，如骨關節炎(OA)、軟骨損傷(CI)、軟骨障礙、軟骨發育不全、骨骼修復等骨骼性病變。

Merck Serono公司(默克雪蘭諾)研發的FGF18(商品名Sprifermin)，可引發軟骨細胞刺激骨基質合成和軟骨細胞更新。2017年ACR大會報告的一項國際多中心2期臨床研究(FORWARD研究)探討了骨關節內注射Sprifermin對膝關節OA的療效，其結果顯示，關節內注射Sprifermin可有效阻止關節軟骨的丟失。治療2年后，Sprifermin組的脛骨關節軟骨厚度呈劑量耐性增加，每6個月100mg組和每12個月100mg組的軟骨厚度分別增加了0.03mm和0.02mm，而安慰劑組減少了0.02mm(P0.001)，各治療組的WOMAC評分均改善50％，研究期間，藥物的安全性良好，各組患者不良反應的發生率相似。Sprifermin治療膝關節炎的Ⅱ期臨床研究已經順利完成，正處于Ⅲ臨床研究。

專利(US7858341)公開了利用基因工程技術，大腸桿菌的原核表達系統，包涵體形式表達無活性的FGF18，再經變性劑溶解、復性、柱層析后得到FGF18，存在工藝繁瑣的弊端。

FGF18是肝素結合蛋白，等電點為9.86，氨基酸序列中含有大量堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)，比例高達20.6％，大量負電荷的氨基酸聚集，互相排斥，造成肽鍵不穩定，N端容易斷裂，用于藥物制劑很不穩定。目前文獻或專利報道的FGF18的結構，均屬于堿性蛋白，結構不穩定，N端容易斷裂；其制備方法為大腸桿菌中包涵體形式表達，胞內不能形成二硫鍵，前處理復雜，復性條件苛刻，工業化生產難度大。

發明內容