[發明專利]一種基于溫敏水凝膠材料的非胰酶消化收獲細胞培養方法

有效

• 申請號: 201910147657.3
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN110055208B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 胡巧玲;董曉飛;王征科;喬豐慧;姜質琦;姚遠
• 申請（專利權）人: 杭州妥愛沐醫療器械有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C08J3/075;C08F251/00;C08F220/54;C08L51/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 萬尾甜;韓介梅

本發明公開了一種基于溫敏水凝膠材料的非胰酶消化收獲細胞培養方法。首先通過乳液聚合法制得水凝膠溶液，該水凝膠在低溫下能保持溶液狀態，在接近人體生理溫度之后能迅速形成水凝膠。基于該溫敏水凝膠材料，本發明通過以下兩種方案實現細胞的非酶收獲：1)將細胞懸液和水凝膠溶液混合后置于37℃細胞培養箱，混合液迅速形成凝膠后加入37℃的培養基進行培養，之后通過降溫釋放細胞；2)將水凝膠溶液先涂在基底表面，置于37℃細胞培養箱中，待形成凝膠后將37℃的細胞懸液和培養基加入進行培養，之后通過降溫釋放細胞。本發明的細胞培養方法無需胰酶消化，無需細胞刮刀，能更好的保存細胞表面蛋白及標記，保證細胞高活力，是一種無損細胞培養方法。

技術領域

本發明涉及一種無需胰酶消化和刮刀的細胞收獲方法，尤其涉及一種基于溫敏水凝膠材料的無胰酶消化收獲細胞培養方法。

背景技術

殼聚糖是源于自然界的氨基多糖，其大分子鏈由乙酰氨基葡萄糖和脫乙酰氨基葡萄糖通過無規或者嵌段分布組成，具有良好的生物相容性、血液相容性、止血性能、抗菌性能以及天然的藥物活性，對傷口的愈合有促進作用，在生物體內可被溶菌酶降解，最終降解產物為氨基葡萄糖，呈弱堿性，與體液的pH值吻合，可被機體吸收，在生物和醫學領域具有巨大的應用潛能。

在對殼聚糖資源的開發利用中，水凝膠是一種重要的形式。水凝膠材料具有多種優良特性，其應用遍布日常生活以及先進工業的各個方面。與傳統水凝膠相比，智能水凝膠因其能對外界環境的細微變化產生響應而受到廣泛關注。其中，對外界溫度刺激產生響應的水凝膠，被稱為溫度敏感水凝膠，也稱作溫敏水凝膠。溫敏水凝膠中含有一定比例的親水基團和疏水基團，溫度的變化可以影響疏水基團之間的相互作用，從而使凝膠的網絡結構改變，導致水凝膠發生相轉變。溫敏殼聚糖水凝膠具備高吸水性、保水性、良好的生物相容性及溫度敏感特性，在生化分離、細胞培養、藥物控制釋放系統等生物材料和醫用材料領域具有廣泛的應用前景。

種子細胞的體外培養對組織工程、細胞治療等再生醫學領域有著重要的意義。目前，在傳統的2D平面和3D支架等細胞培養方法中，胰酶消化、細胞刮刀是廣泛使用的細胞收獲方法。然而，這類方法會導致細胞膜蛋白的損傷，進而導致細胞膜的破壞、細胞表面標記的缺失或者細胞功能的部分損失，這將消弱種子細胞在再生醫學領域的應用價值。溫敏殼聚糖水凝膠材料的研發為解決上述問題提供了新思路。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于溫敏水凝膠材料的非胰酶消化收獲細胞培養方法。

本發明所述的一種具有溫度敏感特性的殼聚糖水凝膠的制備方法是：

1)按重量計，將1-20份殼聚糖、0.1-2份酸、0.01-8份引發劑、1-20份N-異丙基丙烯酰胺單體、50-98份去離子水加入反應器中，攪拌溶解均勻后，在40-90℃反應1-12小時，然后使用去離子水將反應產物透析至中性，真空凍干得到聚N-異丙基丙烯酰胺改性殼聚糖粉末。

2)將1-20份1)中的聚N-異丙基丙烯酰胺改性殼聚糖粉末加入80-99份PBS溶液中，攪拌溶解均勻后得到聚N-異丙基丙烯酰胺改性殼聚糖溶液，簡稱水凝膠溶液。

所述的殼聚糖分子量為3萬-150萬，脫乙酰度為50％-98％。

所述的酸為鹽酸、丙烯酸、檸檬酸、乙酸中的至少一種。

所述的引發劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異丁酸二甲酯、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽、過氧化氫、過硫酸銨、過硫酸鉀、叔丁基過氧化氫中的至少一種。

所述的聚N-異丙基丙烯酰胺改性殼聚糖大分子具有良好的水溶性。所述的溫敏殼聚糖水凝膠在接近人體生理溫度時能迅速(5秒到60分鐘內)形成水凝膠，在室溫下能保持溶液狀態。

本發明所述的一種基于溫敏水凝膠材料的無胰酶消化收獲細胞培養方法，其培養方案包含以下兩種：