[發明專利]一種鴨呼腸孤病毒疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201910147000.7
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN109718370B
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發明（設計）人: 張毓金;嚴悌昆;謝秉超;黃淑芬;張桂平
• 申請（專利權）人: 廣東漁躍生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;A61P31/14;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 44416 廣州科沃園專利代理有限公司
• 代理人: 張帥<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明公開一種鴨呼腸孤病毒疫苗，其是在傳代細胞系BHK?21細胞上接種鴨呼腸孤病毒毒種得到的滅活疫苗。利用Reed?Muench方法測定其病毒滴度可以穩定達到10^7.0?10^7.5TCID50/0.1mL。抗原的穩定生產和高滴度是制備疫苗最關鍵因素,用BHK?21細胞進行鴨呼腸孤病毒增殖其病毒滴度是常規鴨胚法及原代細胞法的10倍以上，如采用生物反應器進行病毒增殖，其病毒滴度可以達到100倍水平。本專利公開的鴨呼腸孤病毒滅活疫苗，產量高，品質穩定，免疫鴨能產生高水平血清中和抗體，免疫效果好，具有巨大的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種鴨呼腸孤病毒疫苗及其制備方法。

背景技術

我國自1997年起，在兩廣、浙、閩、豫和鄂等省爆發了以鴨肝臟上有白色壞死點為特征的病。本病在遇到混合感染或應激時死亡率非常高。通常，此病主要發生于7～45日齡番鴨，致病率高達20％～90％，死亡率為10～50％。感染鴨多表現為腹海，軟腳，附關節或趾關節不同程度腫脹，耐過鴨變為僵鴨；剖檢可見肝、脾、胰、腎和腸的壞死。此以肝臟不規則壞死、出血斑/點和心肌、腔上囊出血為主要特征的新疫病，俗稱鴨新肝病、鴨壞死性肝炎病等，經分離鑒定其病原為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬鴨呼腸孤病毒。

目前尚沒有鴨呼腸孤病毒疫苗上市，也沒有相關的藥物控制該病毒導致的疾病，鴨呼腸孤病毒感染疾病的發生常給養鴨業造成重大經濟損失。

發明內容

本發明要解決的技術問題是有效預防鴨呼腸孤病毒。

為解決上述技術問題，本發明公開一種鴨呼腸孤病毒疫苗，其是在傳代細胞系BHK-21 細胞上接種鴨呼腸孤病毒毒種得到的滅活疫苗。

所述鴨呼腸孤病毒疫苗的制備方法，其包括如下步驟：

(1)BHK-21細胞的傳代與培養：BHK-21細胞經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成細胞單層時，用于繼續傳代或接種病毒；

(2)病毒的接種和培養：取已形成單層的上述細胞，棄去細胞生長液，接種細胞維持液，將呼腸孤病毒毒種按終體積1:100～1:1000接種到制備的細胞，吸附后吸棄病毒液，在用培養液培養至細胞出現病變時收獲；

(3)病毒的收集、濃縮、純化：將上述接種的病變細胞凍融，離心后收集上清液得到病毒原液；通過超濾濃縮上述病毒液即為制苗病毒液；

(4)病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活病毒，即為疫苗抗原；

(5)使用疫苗抗原配置疫苗制劑。

優選所述步驟(1)中的細胞生長液為含5～10％新生牛血清的DMEM培養液,所述細胞生長液中可含雙抗。所述步驟(2)所述細胞維持液為無血清的DMEM培養液，毒種接種到細胞后在37℃吸附30～60分鐘后吸棄病毒液，接毒后在培養液中培養條件為37℃、5％CO2，所述培養液為含1～2％新生牛血清的DMEM培養液，細胞維持液中可含有2mM的谷氨酰胺，更優選含有0.2mM的N-N-二乙基-1-4-苯二胺。所述步驟(3)中所述制苗病毒液每0.1mL病毒大于含量10^7.0TCID₅₀。所述步驟(1)中BHK-21細胞在轉瓶內或在微載體反應器中培養。

所述步驟(5)配置疫苗制劑包括如下步驟：

a)水相制備：取檢驗合格的疫苗抗原96份加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；

b)油相制備：取優質注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-80 4份，先將白油緩慢加溫，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用；

c)乳化：利用IKA乳化機進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即可；