[發(fā)明專利]一種鼻咽癌類器官的培養(yǎng)與鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910146886.3
• 申請(qǐng)日: 2019-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN109679915B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李剛;王顯文;唐浩程;韓日;趙云騰;汪珂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12Q1/6869
• 代理公司: 佛山市神機(jī)營(yíng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44765
• 代理人: 許尤慶

本申請(qǐng)涉及一種鼻咽癌類器官的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及鑒定方法。根據(jù)鼻咽癌來(lái)源細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn)，選用了多種細(xì)胞因子成份按照一定的比例進(jìn)行調(diào)和，經(jīng)過(guò)調(diào)和的培養(yǎng)基中細(xì)胞因子，信號(hào)通路調(diào)控因子含量適宜，鼻咽癌細(xì)胞能夠有效的在3D環(huán)境中形成類器官。本發(fā)明的培養(yǎng)與鑒定方法以及特有的鼻咽癌類器官培養(yǎng)基，可以成功穩(wěn)定的培養(yǎng)出與親本腫瘤病理生理學(xué)特征、基因分型高度一致，組織形態(tài)高度相似的鼻咽癌類器官。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及鼻咽癌類器官培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是用于鼻咽癌類器官的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及鑒定方法。

背景技術(shù)

在我國(guó)鼻咽癌已經(jīng)成為耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種和病死因素，在中國(guó)南部?jī)蓮V地區(qū)(如廣東、廣西等)尤其高發(fā)。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌單純放療即可獲得良好的治療效果，初次治療的5年總生存率可達(dá)75％-84.5％。然而首程治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高達(dá)10-36％。另外，復(fù)發(fā)鼻咽癌患者再程放化療效果不佳，有報(bào)道5年生存率僅為16％-20％。近年來(lái)突飛猛進(jìn)的靶向治療和免疫治療給復(fù)發(fā)鼻咽癌患者帶來(lái)希望的同時(shí)，也帶來(lái)如何從眾多的免疫治療藥物中做出最佳選擇這一重要問(wèn)題。

所有的癌癥研究都依賴穩(wěn)定的細(xì)胞供應(yīng)—可在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的正常細(xì)胞和癌性細(xì)胞。腫瘤3D類器官養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)存在了較長(zhǎng)時(shí)間，在體外用各種必要的生長(zhǎng)因子來(lái)模擬機(jī)體內(nèi)環(huán)境的條件下，提取細(xì)胞加入到3D基質(zhì)膠中培養(yǎng)從而得到了細(xì)胞團(tuán)塊樣組織，其包含了不同組織來(lái)源的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種能不斷自我增殖及分化的細(xì)胞團(tuán)被稱之為類器官。這種高效率的類器官培養(yǎng)可以用來(lái)研究腫瘤的分子信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗腫瘤藥物的研發(fā)與篩選以及腫瘤患者的靶向治療。

現(xiàn)有技術(shù)中，研究較多的類器官有結(jié)腸(SATO T，2011；CN105754948A；CN108396010A)、胃(BARTFELD S，2015)、前列腺(GAO D，2014)、胰腺(2015)、肝(CN1013237888A；BROUTIER L，2018)等，但對(duì)于鼻咽癌組織，還主要是普通的2D原代培養(yǎng)技術(shù)以及常規(guī)原代鑒定方法。在二維培養(yǎng)過(guò)程中鼻咽癌組織難以或不能充分表達(dá)出鼻咽癌組織的特性，使得培養(yǎng)的鼻咽癌組織原代細(xì)胞與患者來(lái)源親本鼻咽癌組織有所差異，不利于研究的進(jìn)行，同時(shí)，常規(guī)免疫組化、HE染色不能證明所培養(yǎng)的原代鼻咽癌細(xì)胞與患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞基因組相匹配。而在3D培養(yǎng)中，缺少必要的適宜的培養(yǎng)基的情況下，鼻咽癌組織的培養(yǎng)同樣不利，難以充分模擬出體內(nèi)鼻咽部粘膜組織及鼻咽癌組織細(xì)胞生理特點(diǎn)。目前暫無(wú)關(guān)于鼻咽癌組織類器官培養(yǎng)方法以及鑒定的研究及報(bào)道，尤其是具體的試驗(yàn)流程、操作步驟、培養(yǎng)條件、即培養(yǎng)基配方以及鼻咽癌類器官鑒定技術(shù)尚無(wú)嘗試及報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鼻咽癌類器官的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及鑒定方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種鼻咽癌類器官的培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基包括以下組分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、ProstaglandinE2、SB202190和FGF-7。

進(jìn)一步地，培養(yǎng)基各成分的含量如下：B27，40-60X稀釋；N-acetylcysteine 0.5-10mM；EGF 1-10ng/ml；Noggin 10-500ng/ml、R-spondin 1 50-500ng/ml；A83-01 100-1000nM；HGF 1-100ng/ml；Nicotinamide 1-100mM；Y-27632 1-50μM；Wnt3a 50-500ng/ml；Glutmax 50-200X稀釋；Heregulinβ-1 5-100ng/ml；Gastrin 0.1-10nM；FGF-10 1-100ng/ml；Prostaglandin E2 0.1-10μM；SB202190 1-100μM；FGF-7 1-100ng/ml。