[發明專利]一種鼻咽癌類器官的培養與鑒定方法

有效

• 申請號: 201910146886.3
• 申請日: 2019-02-27
• 公開（公告）號: CN109679915B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 李剛;王顯文;唐浩程;韓日;趙云騰;汪珂
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學南方醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6869
• 代理公司: 佛山市神機營專利代理事務所(普通合伙) 44765
• 代理人: 許尤慶

1.一種鼻咽癌類器官的培養基，其特征在于，上述培養基包括以下組分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、Prostaglandin E2、SB202190和FGF-7；各組分的含量為：B27，50X稀釋；N-acetylcysteine 1mM；EGF 5ng/ml；Noggin 100ng/ml、R-spondin1 250ng/ml；A83-01 500nM；HGF10ng/ml；Nicotinamide 10mM；Y-27632 10μM；Wnt3a250ng/ml；Glutmax 100X稀釋；Heregulinβ-1 20ng/ml；Gastrin 1nM；FGF-10 10ng/ml；Prostaglandin E2 1μM；SB202190 10μM；FGF-7 10ng/ml。

2.一種鼻咽癌類器官的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：將腫瘤組織在冰上剪碎，加入類器官消化酶I重懸，轉移恒溫搖床消化；第一次消化結束后，離心棄上清，加消化酶II吹打重懸，將離心管放入恒溫搖床消化，加入Hanks液終止消化，經消化酶II消化后為單細胞；第二次消化結束后，離心棄上清，獲得細胞沉淀，再加Hanks液吹打重懸消化的組織沉淀；用細胞篩網過濾細胞，離心棄上清；取紅細胞裂解液重懸細胞后加入HBSS終止；再進行細胞計數，離心得鼻咽癌單細胞沉淀；全程低溫冰上操作，加入計算量的預冷DMEM/F12培養基，再混合matrigel，將膠滴接種至培養皿中；將培養皿靜置，觀察膠滴是否流動，若不流動，放入恒溫孵箱，倒置；加入權利要求1的鼻咽癌類器官培養基；定期更換培養基，培養出鼻咽癌類器官。

3.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：將腫瘤組織在冰上剪碎，加入類器官消化酶I重懸，轉移至37℃、220rpm恒溫搖床消化1.5小時左右；第一次消化結束后，離心棄上清，加2ml消化酶II吹打重懸，將離心管放入37℃、220rpm恒溫搖床消化10min，加入Hanks液終止消化，經消化酶II消化后為單細胞；第二次消化結束后，離心棄上清，獲得細胞沉淀，再加2ml Hanks液吹打重懸消化的組織沉淀；用70μm細胞篩網過濾細胞，離心棄上清；取1ml紅細胞裂解液重懸細胞2-3min后加入1ml HBSS終止；再進行細胞計數，離心得鼻咽癌單細胞沉淀；全程低溫冰上操作，加入計算量的預冷DMEM/F12培養基，再混合matrigel，3000細胞每50μl膠滴混合液，用100μl移液槍將膠滴接種至6cm培養皿中，每個膠滴大小約30μl；將培養皿靜置2min，觀察膠滴是否流動，若不流動，放入37℃，5％CO2恒溫孵箱，倒置45min；加入權利要求1的鼻咽癌類器官培養基，約2ml；每間隔2-3天更換一次培養基，培養出鼻咽癌類器官。

4.根據權利要求3所述的培養方法，其特征在于，膠滴混合液中，DMEM/F12培養基與matrigel的比例為1:2；和/或，消化酶I為collagenase type II和分散酶；和/或，消化酶II為TrypLE Express和DNaseI酶。

5.一種權利要求2-4任一項培養的鼻咽癌類器官的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)鼻咽癌組織做腫瘤全外顯子測序，患者血液做EBV全基因測序；(2)類器官培養成功第一代并傳代后，分別將類器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做腫瘤全外顯子和EBV全基因測序；(3)若患者病理診斷結果為非角化未分化鼻咽癌，則第一代類器官做HE染色證實其為腫瘤細胞；若患者病理診斷結果為分化的鼻咽癌，則需HE染色及免疫組化檢測上皮標志物角蛋白的表達；(4)判斷類器官第一代腫瘤全外顯子測序結果與患者腫瘤組織測序結果比較是否一致、患者血液中EBV測序和類器官EBV測序結果是否一致；上述兩種測序比較結果一致時，則證明該類器官是該患者來源的鼻咽癌腫瘤細胞；(5)類器官第一、三、五、七、九測序結果比對，觀察基因突變是否一致，以鑒定類器官遺傳的穩定性。