[發明專利]一種攜帶功能基團O-糖鏈的制備方法

在審

• 申請號: 201910142856.5
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN109762035A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 張英;王仲孚;南麗婧;黃琳娟
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07H15/20
• 分類號: C07H15/20;C07H1/00
• 代理公司: 西安智萃知識產權代理有限公司 61221
• 代理人: 方力平

本發明具體涉及一種攜帶功能基團O?糖鏈的制備方法，以全乙酰基保護的半乳糖胺為供體，以無水1,2?二氯乙烷為溶劑，以三氟甲烷磺酸銅為催化劑，混合后加入受體，反應溫度為110?135℃，反應時間為6?10h，得O?糖鏈的前體類似物，經硅膠柱層析提純，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚，展開劑為二氯甲烷和甲醇，提純后再經細胞吸收，被細胞中酶利用，加工反應合成攜帶功能基團O?糖鏈。該制備方法克服了傳統化學法釋放糖蛋白O?糖鏈的缺陷，且還使糖鏈帶上紫外基團，提高檢測靈敏度，降低糖鏈極性，使糖鏈在色譜柱上保留，無需進行柱前衍生，便于糖鏈分離，既能用于糖鏈的微量分析又能用于糖鏈的制備，且得到的攜帶功能基團的O?糖鏈還可用于后續糖芯片構建及功能分析。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種攜帶功能基團O-糖鏈的制備方法。

背景技術

O-糖鏈具有重要的生物學功能，如穩定蛋白質結構，參與細胞生長分化、細胞信號傳遞、介導病原菌感染等。但是，對于O-連接糖鏈，首先，O-糖基化沒有保守的特征修飾序列用來預測糖基化位點；其次，已知O-連接糖鏈有8個核心結構，其結構變化與N-連接糖鏈相比更為復雜，合成無模板指導，且表達量低。最后，至今為止還未發現能將O-連接糖鏈整體從肽鏈上釋放下來的通用內切酶，因此目前大多數研究人員都利用化學方法將O-連接糖鏈從肽段上釋放下來，常用的化學法是堿性條件下的β-消除反應和肼解法。

肼解法可以用于釋放N-連接糖鏈和O-連接糖鏈，但是因為該方法的反應條件比較劇烈，反應條件嚴苛，容易引起爆炸且肼是一種劇毒物質。因此，肼解法沒有得到廣泛應用。而β-消除反應是指糖蛋白在堿性環境下不穩定易發生β-消除造成糖肽鍵斷裂從而使O-連接糖鏈從相應的糖蛋白上解離下來。但是非還原條件下糖鏈的半縮醛結構易發生peeling反應。為了阻止peeling反應，加入過量的還原劑將糖鏈的半縮醛結構還原為比較穩定的糖醇結構以保護糖鏈的還原性末端。因此，后續大多已發表的文獻中均采用β-消除的方法進行O-連接糖鏈的釋放，而且隨著研究的不斷發展其方法也在不斷的改進和完善。

Rasilo等用硼烷氨絡合物(NH3·BH3)代替了NaBH4，終止反應時不會產生大量的鹽。Goetz等用28％的氨水溶解的硼烷氨絡合物代替了NaOH和NaBH4，并對釋放的糖鏈進行了甲基化修飾，雖然大大的提高了糖鏈的收率，但由于實驗時間過長以及未能將糖鏈與肽段進行分離，還是造成了糖鏈的大量損失。非還原性釋放及同時標記PMP：此方法由wang等2011年首先提出，基本原理是利用堿性環境對糖鏈進行解離，以及在堿性環境中對釋放的糖鏈標記，以避免發生降解反應。它的最大優點是把釋放和標記糖鏈結合了起來，簡化了分析的步驟，避免了釋放糖鏈過程中的副反應。但該法的樣品需求量比較大，并且對酸性糖鏈的釋放效率比較低。

由于O-糖鏈自身特性的原因，相對于N-糖鏈，O-糖鏈的研究還一直處于基礎研究，對于O-糖鏈的功能研究甚少，因此，發展一種有效制備O-糖鏈的方法，同時實現對糖芯片構建以及后續功能分析具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種攜帶功能基團O-糖鏈的制備方法，該制備方法克服了傳統化學法的缺陷、步驟簡單、成本低廉，將其用于糖鏈的分析制備以及后續糖芯片構建等功能分析。

本發明提供的制備方法是基于寡糖代謝工程，先合成O-糖鏈的前體類似物，也就是O-糖基轉移酶的抑制劑，再以細胞作為O-糖鏈合成的加工反應器，合成攜帶功能基團的O-糖鏈，該底物通過質譜以及核磁對其進行結構表征，糖鏈通過質譜對其進行分析。具體通過以下技術方案實現：

一種攜帶功能基團O-糖鏈的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：制備O-糖鏈的前體類似物：以全乙酰基保護的半乳糖胺為供體，以無水1,2-二氯乙烷為溶劑，以三氟甲烷磺酸銅為催化劑，混合后加入受體，反應溫度為110-135℃，反應時間為6-10h，得O-糖鏈的前體類似物；