[發明專利]一種重組的非洲豬瘟病毒p30亞單位可溶性融合蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910142630.5
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN111607000A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 錢泓;吳有強;張強;徐玉蘭;吳素芳;車影
• 申請（專利權）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/12;G01N33/569;A61P31/20
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產權代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發明公開了一種重組的非洲豬瘟p30亞單位可溶性融合蛋白及其制備方法和應用，所述非洲豬瘟病毒p30亞單位可溶性融合蛋白包括OPTI?p30蛋白和一種伴侶蛋白，其中所述OPTI?p30蛋白的核苷酸序列為經優化后的序列OPTI?p30如SEQ ID NO.1所示。本發明能夠在大腸桿菌中直接可溶性表達P30，克服了現有技術中的諸多問題，且制備方法簡單、成本低。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域。涉及一種重組的非洲豬瘟p30亞單位可溶性融合蛋白，及在制備診斷、預防和治療非洲豬瘟疫苗中的應用。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病。豬是ASFV自然感染的唯一哺乳動物宿主，包括家豬和野豬，尤其是家豬，易感性極高。豬感染非洲豬瘟病毒后臨床上以皮膚充血，內臟器官出血，高熱為特征，發病率及死亡率高達100％。世界動物衛生組織將其列為A類疫病，我國也將其列為一類動物傳染病。

非洲豬瘟自1927年在非洲大陸發現以來，對非洲和歐洲的養豬業造成極大打擊。2018年8月份以來，在我國多個省份爆發，給我國養豬業帶來了嚴重的經濟損失。盡管已經有許多非洲豬瘟的研究性報告，人民對非洲豬瘟也有一定的了解，但目前世界上尚未有有效預防非洲豬瘟的疫苗和治療該病的藥物發現，迫切需要新型疫苗的研發和生產來預防非洲豬瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的蟲媒DNA病毒。病毒顆粒呈二十面體對稱結構，平均直徑200nm，表面有含糖脂類的囊膜覆蓋。其病毒基因組為雙股線性DNA，大小為170-190kb，整個基因組大約有150個ORF，編碼150-200中蛋白質。p30蛋白由CP204L基因編碼的，分子量大小約30kD-32kD的蛋白，因此，有時也稱為p32蛋白。研究發現，p30蛋白與病毒進入宿主細胞的過程有關，針對p30的抗體能夠抑制病毒的內化(Gomez-Puertas et al.,1996)。并且p30蛋白是ASFV的主要結構蛋白，具有很好的抗原性，能誘導機體產生中和抗體p30蛋白能夠在感染的動物體內誘導產生中和抗體(Gemoz-Puertas et al.,1996)，通常作為診斷抗原(Oviedo et al.,1997)。因此，p30是一個很好的保護性抗原。目前，P30已經能成功的表達在原核系統，但表達產量低，且以包涵體形式存在(儲德文，2013)，無法滿足基因工程亞單位疫苗的開發。而利用本發明提供的方法可大量可溶性表達P30蛋白。在當前沒有可能大規模制備滅活疫苗或弱毒疫苗的情況下，確定一種制備該病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一種能夠預防該疾病的亞單位疫苗或具有能夠診斷該疾病的試劑具有重大的意義。

發明內容

在現有技術的基礎上，本發明為了克服現有技術中存在的諸多缺陷(如表達產量低，包涵體表達，純化困難成本相對較高等)，提供了一種制作成本低廉，可在大腸桿菌中直接可溶性表達p30的核苷酸序列及蛋白制備方法。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種可在大腸桿菌中表達p30蛋白的優化后的OPTI-p30的核苷酸序列。為了能夠在大腸桿菌中高效表達P30蛋白，本發明根據GenBank:FR682468.1上已經存在公開的序列(密碼子優化前的編碼P30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，我們對p30基因進行分析，首先對p30基因編碼的密碼子的在原核表達中的密碼子偏好性進行了優化，其次對p30基因的GC含量和mRNA在大腸桿菌的穩定性進行優化。所述最終優化后OPTI-p30的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此，所述非洲豬瘟病毒p30亞單位可溶性融合蛋白包括OPTI-p30蛋白和一種伴侶蛋白，其中所述OPTI-p30蛋白的核苷酸序列為p30蛋白經優化后的序列OPTI-p30如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的優選技術方案中，所述伴侶蛋白為TF蛋白。