[發明專利]一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法

有效

• 申請號: 201910142433.3
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN109872774B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 楊世輝;楊青;唐瑩;易犁
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: G16B20/00
• 分類號: G16B20/00;G16B25/00;C12N15/66;C12N15/70;C12N15/81
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種基于酵母內質網滯留信號篩選系統??Yeast Endoplasmic reticulum Sequestration System(YESS)分析原核生物中蛋白相互作用的方法，基于pESD?PPI質粒構建帶有gfp和mCherry熒光基因的能進行Golden gate組裝的表達質粒pESD?PPI?GFP?mCherry；從UniProt數據庫上運動發酵單胞菌中已有的數據中選擇5對相互作用的蛋白對和未被報道有相互作用的蛋白對分別作為研究運動發酵單胞菌中蛋白相互作用的正對照和負對照；并對分析結果進行量化。本發明提供的用于原核生物蛋白相互作用的方法，可以達到對運動發酵單胞菌中蛋白相互作用進行高通量、定量研究。本方法具有簡單、易于操作、高效、靈敏等諸多優點。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法。

背景技術

目前，業內常用的現有技術是這樣的：

研究蛋白-蛋白相互作用在諸多生物學領域中有著極其重要的意義，對于解析細胞胞內的多種代謝過程，調控網絡以及能量轉化的分子機理至關重要。

目前，驗證蛋白-蛋白相互作用的方法主要包括幾種經典的實驗技術：酵母雙雜交技術，大腸桿菌雜交技術，pull-down技術等等。酵母雙雜交技術的特點在于靈敏、高效、高通量自動化。但在實際應用過程中存在諸多缺點，例如假陰性和假陽性太高；轉化效率低；兩蛋白在不同的載體上，其表達量受載體復制數的影響；同時由于反應發生在細胞核內，所以也并非適用于所有的蛋白質。pull-down技術需要純化蛋白，不能堅持瞬時的蛋白相互作用并且具有假陽性。大腸桿菌雜交技術的宿主是原核生物，會造成很多假陽性和假陰性，并且該技術未實現高通量。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

現有的普遍技術中，由于技術問題或者物種同源性問題導致的假陽性和假陰性太高。

現有的技術無法將原核生物中蛋白相互作用的關系強度進行量化。

現有的技術，能進行高通量的方法中，不適用于所有類型的蛋白。例如酵母雙雜交技術反應發生在細胞核內，所以也并非適用于所有的蛋白質；或者不能檢測瞬時的蛋白相互作用網絡，例如pull-down，Co-IP，TAP。

解決上述技術問題的意義：

該方法可以解決上述問題，提供一種低假陽性和假陰性、高蛋白覆蓋率、高通量、能檢測瞬時相互作用的蛋白并能定量蛋白相互作用強弱的研究方法。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法。

本發明是這樣實現的，一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

基于pESD-PPI質粒構建帶有GFP和mCherry熒光基因的能進行Golden gate組裝表達質粒pESD-PPI-GFP-mCherry；

從數據庫UniProt上分別選擇5對運動發酵單胞菌中相互作用的蛋白對和未被報道有相互作用的蛋白對分別作為分析運動發酵單胞菌中蛋白相互作用的正對照和負對照；

對分析結果進行量化，量化的公式：單熒光比例/(單熒光比例+雙熒光比例)×100％。

進一步，表達載體pESD-PPI-GFP-mCherry構建方法包括：

1)以F-1和R-1為引物，mCherry基因為模板擴增片段1；

2)以片段1為模板，F-2和R-2為引物擴增片段2；

3)以片段2為模板，F-3和R-2為引物擴增片段3；