[發明專利]一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法

有效

• 申請號: 201910142433.3
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN109872774B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 楊世輝;楊青;唐瑩;易犁
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: G16B20/00
• 分類號: G16B20/00;G16B25/00;C12N15/66;C12N15/70;C12N15/81
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

基于pESD-PPI質粒構建帶有gfp和mCherry熒光基因的能進行Golden gate組裝表達質粒pESD-PPI-GFP-mCherry；

從數據庫UniProt上分別選擇5對運動發酵單胞菌中相互作用的蛋白對和未被報道有相互作用的蛋白對分別作為分析運動發酵單胞菌中蛋白相互作用的正對照和負對照；

對分析結果進行量化，量化的公式：單熒光比例/(單熒光比例+雙熒光比例)×100％；

表達載體pESD-PPI-GFP-mCherry構建方法包括：

1)以F-1和R-1為引物，mCherry基因為模板擴增片段1；

2)以片段1為模板，F-2和R-2為引物擴增片段2；

3)以片段2為模板，F-3和R-2為引物擴增片段3；

4)以pESD-PPI為模板，F-4和R-3為引物擴增片段4；

5)以片段3和片段4為模板，F-3和R-3為引物擴增片段5；

6)用NdeI和SalI酶切載體pESD-PPI，獲得酶切載體1；

7)利用Gibson裝配試劑盒組裝片段5和酶切載體1，轉化大腸桿菌感受態，獲得含mCherry的表達載體pESD-PPI-mCherry；

8)以pEZ15a-lacUV5-GFP為模板，F-5和R-4為引物擴增片段6；

9)以片段6為模板，F-5和R-5為引物擴增片段7；

10)以pESD-PPI為模板，F-6和R-6為引物擴增片段8；

11)以片段8和片段7為模板，F-6和R-5為引物擴增片段9；

12)用PstI和BamHI酶切載體pESD-PPI-mCherry，獲得酶切載體2；

13)利用Gibson裝配試劑盒組裝片段9和酶切載體2，轉化大腸桿菌感受態，獲得含GFP和mCherry的表達載體pESD-PPI-GFP-mCherry SEQ ID NO：5。

2.如權利要求1所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表達載體pESD-PPI-GFP-mCherry構建方法進一步包括：

1)構建蛋白的表達載體：

與NH2-TEVF融合表達蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物；

與COOH-TEVF融合表達蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCAGGCC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCTGCCGCC+基因下游引物；

擴增基因片段，并純化；

Golden gate組裝載體和片段；體系：0.05mol基因片段,20ng pESD-PPI-GFP-mCherry，1μL T4 ligase buffer(Thermo)，0.2μL T4 ligase(Thermo)，0.3μL BsaI(NEB)，0.1μLBSA(Takara)；反應程序：37℃，3h；

轉化大腸桿菌感受態；

挑取不發熒光的單菌落做菌體PCR，測序；

2)轉化酵母EBY-100：

酵母劃線活化；

挑取單菌落到1mL YPD培養基中過夜，30℃，220rpm；

第二天早上測量OD_600nm,加入適量YPD，將OD_600nm調到0.1；

30℃220rpm培養4-5h后，OD_600nm為0.4-0.6；

6000rpm離心2min，棄上清；

1mL無菌水洗一次，6,000rpm離心2min，1mL 0.1mol/L LiAc/TE洗一次，6,000rpm離心2min；

100μL 0.1mol/L LiAc重懸，20μL菌液+2μL質粒；

62.4μL 50％PEG3350；

8.23μL 1mol/L LiAc；

9.58μL DMSO；

5μL 50mg/mL ssDNA；

30℃培養箱30min-1h；

42℃水浴鍋15min；

用200μL-1mL 5mmol/L CaCl₂洗一次，6,000rpm離心2min；

100μL 5mmol/L CaCl₂重懸，涂SD-UT平板；

3)酵母表面展示：

挑取單菌落至800μL SD-UT培養基中培養過夜；

轉移合適的菌液于800μL SD-DT培養基中，使起始OD_600nm＝0.8；

取10⁶個細胞，用Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀細胞，棄上清；

用150μL Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀細胞，棄上清；

每個樣品中加20μL Buffer B+0.15uL抗體，避光于4℃避光放置15min；

轉到室溫30min，避光；

取出樣品，6000rpm，4℃，1min沉淀細胞，棄上清，用150uL的Buffer B洗一遍；

加入150μL Buffer C(1×PBS)重懸細胞，6000rpm，4℃，1min沉淀細胞，棄上清；

加300μL Buffer C重懸細胞，轉移到2mL EP管中，流式細胞儀進行結果展示。