[發明專利]一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法

有效

• 申請號: 201910140332.2
• 申請日: 2019-02-17
• 公開（公告）號: CN109777766B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 張晉平;譚毅;丁蘭;丁艷平;孔維寶;王俊龍;羅文萍;傅龍飛;馬君義
• 申請（專利權）人: 西北師范大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法，包括以下操作步驟：(1)取正常妊娠第4天小鼠的子宮組織的組織塊；(2)將組織塊行消化處理后，得到小鼠子宮原代基質細胞的單細胞懸液；(3)將單細胞懸液培養至細胞密度達到75?85％匯合后，換液，去除雜細胞后，向其中加入誘導培養基，誘導小鼠子宮原代基質細胞發生蛻膜化。本發明提供的一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法，操作簡單，可使得分離出的小鼠子宮原代基質細胞具有較高的存活率，同時啟動蛻膜化的成功率較高，為研究人員對蛻膜化機制的研究奠定了基礎。

技術領域

本發明細胞誘導技術領域，具體涉及一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法。

背景技術

隨著工業化的發展和人類生活方式的巨大改變，近年來全世界不孕不育癥患者的比例逐年上升。目前，盡管人工助孕技術得到了較大的發展，但即使在高質量胚胎的情況下，依舊存在著胚胎移植的植入率低以及后續的妊娠成功率低的不足，這主要是由于子宮內膜的生長發育障礙所致。胚胎植入的成功與否，一方面取決于早期胚胎發育形成具有著床能力的囊胚，另一方面取決于子宮內膜協同性的進入接受狀態，即胚胎植入的“窗口期”。在小鼠，囊胚與子宮上皮發生黏附反應以后，在甾體激素的影響下，圍繞囊胚的子宮基質細胞開始廣泛地增殖和分化(即子宮內膜的蛻膜化)。蛻膜化的作用主要是在有功能的胎盤形成之前，為胚泡的發育提供營養，且對發育初期的胚胎起到免疫性保護作用。目前，有關子宮內膜蛻膜化的機制及調節等仍不清楚。因此，研究子宮內膜蛻膜化的過程及相關的機制將具有重要的社會和理論意義?，F有技術中，研究人員經常采用小鼠的子宮原代基質細胞作為實驗對象，來研究子宮內膜蛻膜化的機制，但是存在著小鼠子宮原代基質細胞在誘導蛻膜化之前，死亡率較高的不足，并且存在著子宮原代基質細胞蛻膜化啟動困難、成功率低的缺陷。

發明內容

本發明的目的是提供一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法，以解決現有技術中存在的小鼠子宮原代基質細胞的死亡率高，蛻膜化啟動困難、成功率低的缺陷。

本發明是通過以下技術方案實現的。

一種小鼠子宮原代基質細胞體外誘導蛻膜化的方法，包括以下操作步驟：

(1)取正常妊娠第4天小鼠的子宮組織，采用胰酶溶液消化處理后，去除上皮細胞，得到組織塊；

(2)將組織塊采用質量分數為0.2％的膠原酶II再次進行消化處理后，向其中加入組織塊質量10-15％的離心助劑，然后將混合物進行離心處理，棄去上清液后，加入質量分數為10％的PBS溶液調整細胞濃度，得到小鼠子宮原代基質細胞的單細胞懸液，其中離心助劑由以下重量份的組分制成：干酪素鈉17-22份、透明質酸鈉25-30份、α-酮戊二酸13-16份；

(3)將步驟(2)得到的單細胞懸液培養至細胞密度達到75-85％匯合后，換液，去除雜細胞后，向其中加入誘導培養基，誘導小鼠子宮原代基質細胞發生蛻膜化，其中誘導培養基為含有10-15nM 17β-雌二醇、1-3μM孕酮、8-12μM鹽酸異丙腎上腺素和2％質量分數木炭處理胎牛血清的DMEM-F12培養基。

具體地，上述步驟(1)中，胰酶溶液為胰酶和EDTA溶于無鈣鎂平衡鹽溶液中，經過濾除菌制成，其中胰酶的終質量分數為0.25％，EDTA的終質量分數為0.02％。

具體地，上述步驟(1)中和步驟(2)中，消化處理的操作為：放在4℃冰箱和37℃細胞培養箱中各消化40min后，采用質量分數為10％的PBS溶液終止消化反應反應。

具體地，上述步驟(2)中，離心處理時，離心機的轉速為3000rpm，離心時間為15min。

由以上的技術方案可知，本發明的有益效果是：