[發明專利]一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法

在審

• 申請號: 201910139339.2
• 申請日: 2019-02-25
• 公開（公告）號: CN109943500A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 黎娟;鄭重誼;黎鵬;劉智炫;周清明
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 長沙和雅知識產權代理事務所(普通合伙) 43238
• 代理人: 林傳貴

1.一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

表面消毒：篩選顆粒飽滿的水稻種子，先用有效氯含量為1％的NaCLO漂洗10分鐘，漂洗后收集種子，再用無菌水清洗5次，每次1分鐘；

種子研磨：根據研磨罐的容量，加入適量的水稻種子，研磨1-2分鐘，得到種子研磨液；

分離純化：將所述種子研磨液涂布在培養基中，在所述培養基中培養水稻種子的內生細菌，采用30℃恒溫培養箱培養，不定期觀察出菌情況；挑選不同外觀形態的單菌落，進行保存；

鑒定：對所有分離出來的種子內生菌進行生物學特性分析：產鐵載體功能定性檢測、分泌IAA功能檢測、溶磷功能檢測、固氮功能檢測、耐Cd性檢測和降鎘功能檢測；同時對其進行分子生物學鑒定；

篩選：通過對所有菌株的生物學特性檢測的結果，選擇其中綜合生理功能合格的具有降鎘功能的菌株作為優勢菌進行保存。

2.根據權利要求1所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟分離純化中，采用R2A、1/2LB和1/2PDA三種種培養基培養內生細菌，將種子研磨液涂布在R2A、1/2LB和1/2PDA三種平板培養基上。

3.根據權利要求1所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟鑒定中，所述產鐵載體功能定性檢測過程為：將分離純化后的種子內生細菌接種到具有CAS檢測液的檢測平板上，在28℃的培養箱中培養46個小時，觀察平板中菌落周圍橙黃色暈圈的形成和大小。

4.根據權利要求1所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟鑒定中，所述分泌IAA功能檢測過程為：將分離純化后的種子內生細菌接種于含有100mg/L的L-色氨酸的液體培養基中，在30℃和180r/min條件下進行搖床培養1天后，取50μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入比色液，將白色陶瓷板于室溫避光放置30分鐘后觀察，顏色變紅者為陽性，表示能夠分泌IAA。

5.根據權利要求1所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟鑒定中，所述溶磷功能檢測過程為：將斜面菌種用0.8％的生理鹽水洗脫，并且于40℃活化48h后，再把溶磷細菌稀釋涂布于平板上，40℃培養5d，每天定時測量溶磷圈直徑與菌落直徑，計算兩者比值，初步定性該菌溶磷能力大小，比值越大，說明溶磷能力越強。

6.根據權利要求4所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟鑒定中，所述分泌IAA功能檢測過程中的比色液為體積50ml含有35％的HCLO₄的液體和體積1ml含有0.5mol/L的FeCL₃液體的混合液。

7.根據權利要求1所述的一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟鑒定中，所述降鎘功能檢測過程為：將降鎘菌添加在水稻水培液中，在水稻生長的過程中觀察并檢測水稻的鎘含量，檢測結果無鎘含量，判定為具有降鎘功能的降鎘菌。