[發(fā)明專利]一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910139339.2
• 申請(qǐng)日: 2019-02-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109943500A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎娟;鄭重誼;黎鵬;劉智炫;周清明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20
• 代理公司: 長(zhǎng)沙和雅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43238
• 代理人: 林傳貴

本申請(qǐng)公開(kāi)了一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法。包括以下步驟：表面消毒：篩選顆粒飽滿的水稻種子，先用有效氯含量為1％的NaCLO漂洗，漂洗后收集種子，再用無(wú)菌水清洗；分離純化：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，采用30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不定期觀察出菌情況；挑選不同外觀形態(tài)的單菌落，進(jìn)行保存；鑒定：對(duì)所有分離出來(lái)的種子內(nèi)生菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析：產(chǎn)鐵載體功能定性檢測(cè)、分泌IAA功能檢測(cè)、溶磷功能檢測(cè)、固氮功能和耐Cd性檢測(cè)；同時(shí)對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；篩選：通過(guò)對(duì)所有菌株的生物學(xué)特性檢測(cè)的結(jié)果，選擇其中綜合生理功能優(yōu)勢(shì)的菌株作為優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行保存。本方法能夠從水稻種子中全面地篩選出降鎘菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及細(xì)菌篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法。

背景技術(shù)

水稻種子是內(nèi)生細(xì)菌的重要載體，水稻植株不同部位中的內(nèi)生細(xì)菌大部分都是通過(guò)種子遺傳而來(lái)，對(duì)于水稻的生命活動(dòng)起到了重要作用。相比于其他傳統(tǒng)的微生物，與水稻植株有著先天性的緊密聯(lián)系，能夠“和諧聯(lián)合”的共生，因此水稻種子是研究?jī)?nèi)生細(xì)菌抑制水稻鎘吸收能力的理想對(duì)象。

其次，分析水稻種子中具有潛在抑制水稻鎘吸收能力的內(nèi)生細(xì)菌多樣性能夠起到有效指導(dǎo)作用，有助于篩選出更加高效的功能菌株。

最后，之前關(guān)于水稻鎘吸收能力的研究大多關(guān)注微生物的直接作用效果，或是微生物的使用方法。但是由于微生物對(duì)環(huán)境條件敏感，定殖能力差，作用效果不穩(wěn)定，所以在實(shí)際應(yīng)用中不能很好的發(fā)揮效果。外加微生物和水稻內(nèi)生菌群落作為一個(gè)相互作用的體系，關(guān)于系統(tǒng)中微生物群落的變化卻鮮有報(bào)道。本研究將探究水稻內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性和組成的變化，聯(lián)系水稻鎘吸收能力的變化，揭示內(nèi)生細(xì)菌的作用機(jī)制，對(duì)于實(shí)際的農(nóng)業(yè)應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義。

在細(xì)菌的篩選方法中，根據(jù)細(xì)菌體積大小來(lái)離心分離細(xì)菌，可以快速篩選出所需細(xì)菌，但很多細(xì)菌分離裝置只有一個(gè)離心網(wǎng)，離心網(wǎng)的孔徑大小不變，不能進(jìn)行調(diào)節(jié)，每個(gè)細(xì)菌分離裝置也只能篩選出同一種顆粒大小的細(xì)菌，細(xì)菌分離裝置不能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行多級(jí)分離，不能滿足對(duì)多種大小不同細(xì)菌的分離的要求，滿足不了實(shí)驗(yàn)的需求，不利于對(duì)細(xì)菌多樣化的實(shí)驗(yàn)研究。

鑒于此，本發(fā)明所述的一種降鎘菌的篩選方法，有用選擇培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行篩選，有通過(guò)細(xì)菌體積大小對(duì)細(xì)菌進(jìn)行篩選，用三種培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行篩選，可以更加全面的保留種子里面的內(nèi)生菌，采用多種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，保證了篩選的高精度。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，采用三種培養(yǎng)基進(jìn)行降鎘菌篩選，同時(shí)采用多種篩選指標(biāo)進(jìn)行鑒定，提高了篩選精度，同時(shí)能夠保證篩選細(xì)菌的全面性。

本發(fā)明提供一種從水稻種子中篩選降鎘菌的篩選方法，包括以下步驟：

表面消毒：篩選顆粒飽滿的水稻種子，先用有效氯含量為1％的NaCLO漂洗10分鐘，漂洗后收集種子，再用無(wú)菌水清洗5次，每次1分鐘；

種子研磨：根據(jù)研磨罐的容量，加入適量的水稻種子，將研磨罐放入適配器中，設(shè)置參數(shù)，啟動(dòng)研磨儀，研磨1-2分鐘；

分離純化：將所述種子研磨液涂布在培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，采用30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不定期觀察出菌情況；挑選不同外觀形態(tài)的單菌落，進(jìn)行保存；

鑒定：對(duì)所有分離出來(lái)的種子內(nèi)生菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析：產(chǎn)鐵載體功能定性檢測(cè)、分泌IAA功能檢測(cè)、溶磷功能檢測(cè)、固氮功能、耐Cd性檢測(cè)和降鎘功能檢測(cè)；同時(shí)對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；

篩選：通過(guò)對(duì)所有菌株的生物學(xué)特性檢測(cè)的結(jié)果，選擇其中綜合生理功能合格的具有降鎘功能的菌株作為優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行保存。

進(jìn)一步地，所述步驟分離純化中，采用R2A、1/2LB和1/2PDA三種種培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，將種子研磨液涂布在R2A、1/2LB和1/2PDA三種平板培養(yǎng)基上。