[發明專利]用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒的實時熒光定量PCR引物、探針及其應用

在審

• 申請號: 201910138489.1
• 申請日: 2019-02-25
• 公開（公告）號: CN109825642A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 王靖飛;劉春國
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒(Fur seal feces?associated circular ssDNA virus，FSfaCV)的實時熒光定量PCR引物、探針及其應用。所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。采用本發明設計的特異性FSfaCV熒光定量PCR檢測引物和探針，病毒基因組在1.52拷貝/μL以上時均可準確檢測出FSfaCV，且不與豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型、非洲豬瘟病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、H3N2和H1N1亞型豬流感病毒、豬呼腸病毒反應，具有靈敏度高、特異性好、方便、準確和高效的優點。

技術領域

本發明涉及一種檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒的實時熒光定量PCR引物、探針及其應用。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒(Fur seal feces-associated circularssDNA virus，FSfaCV)是一種新型環狀單鏈DNA病毒，屬于環狀病毒科，環病毒屬。該病毒于2012年首次從新西蘭毛皮海豹糞便中鑒定出來，病毒(a50株)基因組全長為2925個核苷酸(nt)，包括兩個開放閱讀框，分別編碼Rep復制酶和Cap衣殼蛋白。日本學者于2014年從仔豬糞便樣本中也檢測到該病毒，鑒定出一株病毒FSfaCV-J1，其基因組全長為2916nt，與新西蘭a50毒株的核苷酸同源性為92％；病原性檢測發現，該病毒在仔豬中的陽性率達到76％(65/85)。迄今為止，只有這兩起關于該病毒的相關報道。該病毒的生態學分布、宿主嗜性、病原學特征、診斷方法、以及對豬的致病特性等相關信息均鮮為人知。

因此，開展FSfaCV的流行病學研究具有重要意義。而診斷方法的建立則是開展該病毒流行病學研究的基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒的實時熒光定量PCR引物及探針組合，通過采用Taqman實時熒光定量PCR方法對FSfaCV進行鑒定，從而替代普通PCR方法，使檢測更準確和高效。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明的一種用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒的實時熒光定量PCR引物及探針組合，其中，所述的引物由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的探針的5’端標以熒光報告基團，3’端標以熒光淬滅基團。

其中，優選的，所述的探針的5’端標以熒光報告基團Fam，3’端標以熒光淬滅基團Tam。

其中，優選的，所述的PCR引物及探針用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒時，其實時熒光定量PCR反應體系為25μL，其中包括：

其中，優選的，模板中病毒基因組濃度為1.52拷貝/μL以上。

其中，優選的，所述的PCR引物及探針用于檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒時，實時熒光定量PCR反應條件為：95℃3分鐘；95℃15秒，60℃30秒，40個循環；在循環延伸時進行熒光信號檢測。

進一步的，本發明還提出了所述的PCR引物及探針組合在制備檢測毛皮海豹糞便相關環狀單鏈DNA病毒試劑中的應用。

相較于現有技術，本發明的有益效果是：

1、本發明通過設計一對特異性FSfaCV熒光定量PCR檢測引物和探針，能夠便于對FSfaCV的檢測，從而提高檢測效率。