[發(fā)明專利]一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組、試劑盒以及方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910138150.1 | 申請日： | 2019-02-25 |
| 公開（公告）號： | CN109750122A | 公開（公告）日： | 2019-05-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 郭效珍;劉存霞;胡峰;趙巧雅;姜亦飛;黃兵;馬秀麗;李玉峰;于可響;宋敏訓(xùn) | 申請（專利權(quán)）人： | 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務(wù)所 11569 | 代理人： | 代芳 |
| 地址： | 250000 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 核苷酸序列 特異性引物組 禽流感病毒 亞型 試劑盒 種檢測 禽流感病毒亞型 檢測技術(shù)領(lǐng)域 試劑盒操作 引物組 檢測 | ||
本發(fā)明提供了一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組、試劑盒以及方法，屬于禽流感病毒亞型檢測技術(shù)領(lǐng)域，所述方法檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組，包括N2?F和N2?R；H5?F和H5?R以及H9?F和H9?R；所述N2?F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2?R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述H5?F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5?R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述H9?F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9?R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。本發(fā)明提供的引物組和試劑盒操作簡單、特異性好。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于禽流感病毒亞型檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組、試劑盒以及方法。
背景技術(shù)
禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一種急性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為A類疾病，我國將其列為一類動物疫病，禽流感給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的差異，將血凝素(HA)分為16個亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶(NA)分為9個亞型(N1-N9)。AIV的常用檢測方法有血凝抑制試驗(yàn)(HI)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)、RT-PCR法等。HI、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等方便快捷，但敏感性較低，不適宜于微量病毒的檢測；ELISA、熒光抗體法較為成熟，但不及RT-PCR方法敏感；常規(guī)RT-PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，需要特殊的基因擴(kuò)增儀器。目前對于禽流感病毒不同亞型的檢測尚沒有一種靈敏度高且操作方便的方法。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種靈敏度高、特異性好的檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物、試劑盒以及方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：
一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；
所述N2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；
所述H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；
所述H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。
優(yōu)選的，所述引物組中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用濃度獨(dú)立為15～25μmol/μL。
本發(fā)明提供了一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的試劑盒，包括所述的引物組。
優(yōu)選的，所述試劑盒還包括擴(kuò)增緩沖液、重組酶聚合酶、ddH2O和醋酸鎂。
優(yōu)選的，所述擴(kuò)增緩沖液為RehydrationBuffer。
優(yōu)選的，所述醋酸鎂的濃度為250～300mmoL/L。
優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。
本發(fā)明提供了一種非疾病診斷目的的檢測禽流感病毒AIV不同亞型的方法，包括以下步驟：
1)按照TwistAmp DNAAmplification Kits試劑盒操作說明，將待測樣品的DNA、引物組、Rehydration buffer和ddH2O混勻后加入醋酸鎂獲得擴(kuò)增體系；
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