[發(fā)明專利]一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組、試劑盒以及方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910138150.1
• 申請日: 2019-02-25
• 公開（公告）號: CN109750122A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭效珍;劉存霞;胡峰;趙巧雅;姜亦飛;黃兵;馬秀麗;李玉峰;于可響;宋敏訓(xùn)
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的特異性引物組，其特征在于，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；

所述N2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用濃度獨(dú)立為15～25μmol/μL。

3.一種檢測禽流感病毒AIV不同亞型的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括擴(kuò)增緩沖液、重組酶聚合酶、ddH₂O和醋酸鎂。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增緩沖液為RehydrationBuffer。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述醋酸鎂的濃度為250～300mmoL/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。

8.一種非疾病診斷目的的檢測禽流感病毒AIV不同亞型的方法，包括以下步驟：

1)按照TwistAmp DNAAmplification Kits試劑盒操作說明，將待測樣品的DNA、引物組、Rehydration buffer和ddH₂O混勻后加入醋酸鎂獲得擴(kuò)增體系；

2)將所述擴(kuò)增體系置于40℃進(jìn)行擴(kuò)增15min后，冷卻至20～30℃；混勻后，置于40℃進(jìn)行再次擴(kuò)增35min獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)收集步驟2)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)226bp和366bp兩條帶，則待測樣品為H5N2亞型；若瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)226bp和460bp兩條帶，則待測樣品為H9N2亞型。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的擴(kuò)增體系以50μL計(jì)，包括待測樣品的DNA 10μL、引物組2.4μL、擴(kuò)增緩沖液29.5μL、ddH₂O 5.6μL和醋酸鎂2.5μL。