[發(fā)明專利]一種肝性腦病細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910134467.8
• 申請(qǐng)日: 2019-02-23
• 公開（公告）號(hào): CN109880799A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳永平;金曉芝;陳達(dá)之;吳發(fā)玲;張磊;潘彤彤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

本發(fā)明屬于脊椎動(dòng)物的新品種技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種肝性腦病細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的分離、純化及細(xì)胞培養(yǎng)小室里共培養(yǎng)，加入不同濃度氯化銨后形成肝性腦病細(xì)胞模型；解決了目前肝性腦病主要采用動(dòng)物模型，其成本高，耗費(fèi)時(shí)間長，及過于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果易產(chǎn)生偏差；而現(xiàn)有的有關(guān)肝性腦病的細(xì)胞模型均過于粗糙、簡單，不能很好的模擬疾病過程的問題。本發(fā)明一種肝性腦病細(xì)胞模型的建立，尤其是以星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)及不同濃度高氨為設(shè)計(jì)對(duì)象的模型，對(duì)肝性腦病的研究及治療十分重要。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于脊椎動(dòng)物的新品種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種肝性腦病細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：肝性腦病模型主要采用各種動(dòng)物模型，包括外科方法和肝毒性藥物法，或兩者結(jié)合。近來有部分實(shí)驗(yàn)將氯化銨加入單一的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞用于研究肝性腦病，但涉及的細(xì)胞均十分單一，忽略了該疾病重要靶細(xì)胞間的相互作用，本發(fā)明首次將肝性腦病兩種最重要的細(xì)胞相結(jié)合用于構(gòu)建肝性腦病細(xì)胞模型，首次提出采用不同氨濃度構(gòu)建不同程度肝性腦病細(xì)胞模型。

肝性腦病是由嚴(yán)重肝病或廣泛性門-體靜脈分流引起的以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的綜合征，是嚴(yán)重危害人類生命與健康的重大醫(yī)學(xué)問題。迄今肝性腦病的發(fā)病機(jī)理與病理生理仍未完全闡明，臨床上用于預(yù)防和治療肝性腦病的方法非常有限。

氨中毒學(xué)說被認(rèn)為是肝性腦病的主要原因，肝性腦病時(shí)，機(jī)體內(nèi)氨生成過多而肝臟對(duì)氨的清除能力下降，致使血氨濃度顯著升高，高濃度的血氨通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，從而引起腦功能障礙。氨的毒性作用主要有：(1)谷氨酰胺合成消耗大量ATP，干擾腦細(xì)胞的能量代謝；(2)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡；(3)影響神經(jīng)元膜上Na⁺-K⁺-ATP酶。因腦內(nèi)不表達(dá)與鳥氨酸循環(huán)相關(guān)的酶，所以主要依靠谷氨酰胺合成途徑清除氨，谷氨酰氨合成酶(glutaminesynthetase，GS)主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞，因而星形膠質(zhì)細(xì)胞成為氨神經(jīng)毒性的最主要的靶細(xì)胞。而神經(jīng)元細(xì)胞作為腦內(nèi)最基本的信息傳感器細(xì)胞其結(jié)構(gòu)功能的維持很大程度上依靠星形膠質(zhì)細(xì)胞支持和指導(dǎo)，且氨能直接干擾神經(jīng)元細(xì)胞膜上Na⁺-K⁺-ATP酶。因此以高氨、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞為主要內(nèi)容而建立起來的肝性腦病細(xì)胞模型對(duì)此疾病的研究十分有用。

目前對(duì)肝性腦病的研究主要采用動(dòng)物模型，包括外科法和肝毒性藥物法。前者雖時(shí)限不長(數(shù)日至數(shù)周)，但模型死亡率較高，尤其對(duì)需進(jìn)行較長時(shí)間干預(yù)的實(shí)驗(yàn)，常不能順利進(jìn)行。而肝毒性藥物法造模則需要時(shí)間過長(數(shù)周至數(shù)月)，且由于個(gè)體差異，部分模型雖已到達(dá)肝衰、肝硬化失代償期階段，但仍未能發(fā)生肝性腦病，或肝性腦病狀態(tài)時(shí)間過短(數(shù)小時(shí)即死亡)。所以一方面動(dòng)物模型成本高，耗費(fèi)時(shí)間長，而細(xì)胞模型成本低(數(shù)只新生鼠便可滿足基本實(shí)驗(yàn)所需)，成功率高，總造模時(shí)間一般10天左右，細(xì)胞可傳代，甚至可凍存，便于重復(fù)實(shí)驗(yàn)及后續(xù)的進(jìn)一步研究。另一方面，如果不進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，直接進(jìn)入體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雖然能完整地保留系統(tǒng)的各種特征，但是過于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和大量不可控因素以及動(dòng)物之間的個(gè)體差異等因素將導(dǎo)致相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，例如處于同一分期肝性腦病的模型，其肝臟在合成、代謝等功能方面卻千差萬別，必將影響干預(yù)措施療效的評(píng)判，這將對(duì)研究造成很大的障礙。而細(xì)胞模型不可控因素少，更加便于通路水平層面研究肝性腦病。另細(xì)胞模型可以選擇人源細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這是動(dòng)物模型無法克服的障礙。但目前對(duì)于肝性腦病的細(xì)胞模型，僅部分實(shí)驗(yàn)簡單涉及高氨狀態(tài)下某一細(xì)胞的研究，不能很好模擬肝性腦病腦內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)及作用，因此一種能較完善模擬肝性腦病的細(xì)胞模型的建立十分重要。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

(1)目前對(duì)肝性腦病的采用動(dòng)物模型，成本高，耗費(fèi)時(shí)間長。

(2)目前對(duì)肝性腦病的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因直接進(jìn)入體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，過于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和大量不可控因素以及動(dòng)物之間的個(gè)體差異等因素將導(dǎo)致相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，造成很大的障礙。