[發明專利]一種肝性腦病細胞模型及其構建方法

在審

• 申請號: 201910134467.8
• 申請日: 2019-02-23
• 公開（公告）號: CN109880799A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 陳永平;金曉芝;陳達之;吳發玲;張磊;潘彤彤
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

1.一種肝性腦病細胞模型的構建方法，其特征在于，所述肝性腦病細胞模型的構建方法包括：

步驟一，出生24小時內的SD大鼠用75％酒精消毒，超凈臺里取兩側大腦皮層組織，37℃條件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培養基終止消化，洗滌兩次后加培養基成初細胞懸液，經200目篩網濾過后接種至多聚賴氨酸包被培養瓶中；于37℃，5％CO₂培養箱孵育24h后換液，后每培養3天換一次液；約9-12d，細胞鋪滿瓶底后，培養瓶內保持無菌于恒溫搖床震蕩18h，舍棄脫落細胞懸液后，進行GFAP免疫熒光鑒定，鑒定成功的細胞即為原代星形膠質細胞；

步驟二，-20℃冷凍麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超凈臺里取胚胎鼠兩側海馬組織，37℃條件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培養基終止消化，洗滌兩次后加NB+B27培養基成初細胞懸液，經200目篩網濾過后接種至多聚賴氨酸包被培養瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L現配谷氨酰胺培養基，37℃，5％CO₂培養箱孵育，貼壁4h換液，后每培養3天換一次液，每一次換半液，約5d，進行MAP2免疫熒光鑒定，鑒定成功的細胞即為神經元細胞；

步驟三，無菌條件下，密度為1*10⁵/ml的星形膠質細胞接種在帶有Transwell培養小室的下層培養板上于含10％胎牛血清DMEM培養基中過夜，后換成NB+B27+0.5mmol/L現配谷氨酰胺培養基加入不同濃度NH₄Cl，于37℃，5％CO₂培養箱孵育24h；

步驟四，無菌條件下，上述帶Transwell培養小室的培養板的微孔膜上接種密度為1*10⁵/ml的神經元細胞，于37℃，5％CO₂培養箱繼續孵育24h-48h，形成神經元細胞和星形膠質細胞共培養體系。

2.如權利要求1所述的肝性腦病細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟一中恒溫小床37℃，250r/min。

3.如權利要求1所述的肝性腦病細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟二中培養細胞的培養基為不含血清的NB+B27+0.5mmol/L現配谷氨酰胺。

4.如權利要求1所述的肝性腦病細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟三中NH₄Cl濃度為1-10mM不等，隨濃度加大代表模型肝性腦病程度加劇，以模擬不同程度的肝性腦病。

5.如權利要求1所述的肝性腦病細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟四中將神經元細胞與處于高氨狀態的星形膠質細胞培養小室共培養。

6.一種由權利要求1所述肝性腦病細胞模型的構建方法構建的肝性腦病細胞模型。

7.一種如權利要求4所述的肝性腦病細胞模型，其特征在于，所述肝性腦病細胞模型包含星形膠質細胞、神經元細胞及不同濃度高氨。

8.一種如權利要求4所述肝性腦病細胞模型在肝性腦病藥物中的應用。