[發明專利]一種靶向性抗腫瘤T細胞及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910134461.0
• 申請日: 2019-02-23
• 公開（公告）號: CN111378623B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 何清;廖雪姣;王輝;唐奇遠;舒丹;唐嫻
• 申請（專利權）人: 深圳市第三人民醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種靶向性抗腫瘤T細胞，其特征在于，所述靶向性抗腫瘤T細胞為帶靶向CD133的嵌合抗原受體CAR-CD133和帶靶向AFP的嵌合抗原受體CAR-AFP的雙靶點嵌合抗原受體T細胞，或者為帶所述CAR-CD133的嵌合抗原受體T細胞和帶所述CAR-AFP的嵌合抗原受體T細胞的混合，或者為帶所述CAR-CD133的嵌合抗原受體T細胞和帶所述CAR-AFP的嵌合抗原受體T細胞的一種或多種與帶所述雙靶點嵌合抗原受體T細胞的混合；其中，所述CAR-CD133包括從氨基端到羧基端順次連接的靶向CD133的單鏈抗體、胞外鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區的氨基酸序列，所述CAR-AFP包括從氨基端到羧基端順次連接的靶向AFP的單鏈抗體、胞外鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區的氨基酸序列；

其中，所述靶向CD133的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向AFP的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.如權利要求1所述的靶向性抗腫瘤T細胞，其特征在于，所述靶向CD133的單鏈抗體的編碼基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向AFP的單鏈抗體的編碼基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.如權利要求1所述的靶向性抗腫瘤T細胞，其特征在于，所述CAR-CD133的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-AFP的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

4.一種重組病毒載體，其特征在于，包括如權利要求1-3任一項所述的靶向性抗腫瘤T細胞中所述CAR-CD133和/或CAR-AFP的編碼基因。

5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包括如權利要求4所述的重組病毒載體。

6.一種靶向性抗腫瘤T細胞的制備方法，其特征在于，包括：

(1)分別提供靶向CD133的嵌合抗原受體CAR-CD133的編碼基因和靶向AFP的嵌合抗原受體CAR-AFP的編碼基因；

所述CAR-CD133的編碼基因包括從5’端到3’端順次連接信號肽的編碼基因、靶向CD133的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因和胞內信號區的編碼基因；所述CAR-AFP的編碼基因包括從5’端到3’端順次連接信號肽的編碼基因、靶向AFP的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因和胞內信號區的編碼基因；

其中，所述靶向CD133的單鏈抗體的編碼基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所對應的核苷酸序列，所述靶向AFP的單鏈抗體的編碼基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所對應的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-CD133的編碼基因和所述CAR-AFP的編碼基因分別插入到pWPXLd載體中，得到pWPXLd-CAR-CD133重組質粒和pWPXLd-CAR-AFP重組質粒；

(3)分別對所述pWPXLd-CAR-CD133重組質粒和所述pWPXLd-CAR-AFP重組質粒進行包裝，得到帶CAR-CD133編碼基因的第一重組慢病毒以及帶CAR-AFP編碼基因的第二重組慢病毒；

(4)將所述第一重組慢病毒與所述第二重組慢病毒分開或同時地聯合轉染CD3陽性T淋巴細胞，經分離獲得靶向性抗腫瘤T細胞。

7.如權利要求6所述的靶向性抗腫瘤T細胞的制備方法，其特征在于，所述CAR-CD133的編碼基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述CAR-AFP的編碼基因包括如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。

8.如權利要求6所述的靶向性抗腫瘤T細胞的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述第一重組慢病毒與第一重組慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。