[發明專利]一種flagellin-fiber2融合蛋白、其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910133195.X
• 申請日: 2019-02-22
• 公開（公告）號: CN109867727A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 侯磊;劉爵;韋莉;王菁;全榮;朱珊珊
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/866;C12N15/66;A61K39/39;A61K39/235;A61P31/20
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種flagellin- fiber2融合蛋白，其特征在于，其為禽4型腺病毒fiber2 蛋白與去除毒力的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白flagellin融合表達的蛋白；所述flagellin- fiber2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其對禽4型腺病毒病具有高免疫保護效果；所述flagellin- fiber2融合蛋白為利用桿狀病毒表達系統表達。

2.一種編碼權利要求1所述的flagellin-fiber2 融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.一種flagellin-fiber2 融合蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

S1、人工合成flagellin-fiber2融合蛋白的基因，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列編碼如SEQ ID NO.1所示的氨基酸；

S2、將所述融合蛋白的基因連接到pFastBac-HA 質粒，得到重組載體pFastBac-HA-flagellin-fiber2；

S3、將所述重組載體pFastBac-HA-flagellin-fiber2轉化E.coli DH10Bac感受態細胞，利用感受態細胞中Tn7 轉座系統，將融合基因轉座至桿狀病毒穿梭載體Bacmid 中，得到重組質粒Bacmid-flagellin-fiber2；

S4、將所述重組質粒Bacmid-flagellin-fiber2轉染入Sf9 昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒，并以Sf9昆蟲細胞為宿主細胞培養病毒，采用Ni-NAT 親和層析法純化帶有His 標簽的目的蛋白；

在步驟S1中，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟S2中，將所述融合蛋白的基因連接到pFastBac-HA 質粒的操作為：

S201、先采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的引物擴增步驟S1人工合成的所述融合蛋白的基因，純化擴增產物；

S202、用限制性內切酶NotI 和HindIII 對載體pFastBac-HA和純化后的PCR 產物進行雙酶切，16℃連接過夜，轉化入DH5α 感受態細胞，挑取PCR 鑒定為陽性的單菌落搖菌提質粒，獲得陽性pFastBac-HA 重組質粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，還包括對轉化E.coliDH10Bac的感受態細胞進行鑒定，所采用的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列；

在步驟S4中，所述目的蛋白的分子量為100kD。

7.一種根據權利要求1所述的flagellin- fiber2融合蛋白或權利要求4-6中任一項制備方法制備的flagellin- fiber2融合蛋白的應用，其特征在于，所述flagellin- fiber2融合蛋白用于制備防控禽4型腺病毒病的疫苗。