[發(fā)明專利]一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910132697.0
• 申請(qǐng)日: 2019-02-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109675111B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張馨月;汪振星;孫家明;周牧冉;羅超;陳靂風(fēng);曾宇陽(yáng);侯金飛;牟珊;黎媛;方慧敏;王冰倩;齊鈺涵;張郭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號(hào): A61L27/36
• 分類號(hào): A61L27/36;A61L27/08;A61L27/24;A61L27/50
• 代理公司: 武漢楚天專利事務(wù)所 42113
• 代理人: 楊宣仙

本發(fā)明提供一種膠原蛋白?氧化石墨烯?脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法。其方法具體如下：取人脂肪組織反復(fù)凍融后乳化得到脂肪，并離心去除上層油和下層水，取中間層采用生理鹽水、胰蛋白酶?EDTA消化液、異丙醇、混合酶溶液進(jìn)行脫細(xì)胞處理，再用α?淀粉酶水溶液和醋酸勻漿得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)溶液，并與膠原蛋白?氧化石墨烯溶液混合作為分散相通入微流控芯片，將含有span?80的正癸醇作為連續(xù)相通入微流控芯片，獲得包裹有正癸醇的脫細(xì)胞基質(zhì)?膠原蛋白?氧化石墨烯液滴，并通過(guò)交聯(lián)液交聯(lián)得到所述微載體。本發(fā)明能夠生產(chǎn)成分均一的脫細(xì)胞基質(zhì)微載體，得到的微載體更利于細(xì)胞生長(zhǎng)，可用于脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織工程生物支架微載體，具體涉及一種應(yīng)用微流控芯片的膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的構(gòu)建方法，可增加脂肪干細(xì)胞的黏附，是一種新型微載體。

背景技術(shù)

軟組織缺損是臨床面臨的常見(jiàn)難題。現(xiàn)有的皮瓣移植、脂肪填充、透明質(zhì)酸填充等方法存在有創(chuàng)傷、填充物易吸收、炎癥反應(yīng)等缺點(diǎn)。組織工程的方法將種子細(xì)胞和生物支架材料結(jié)合后進(jìn)行填充，可以很大程度避免這些問(wèn)題，但目前常用的生物支架材料如殼聚糖、纖維蛋白、透明質(zhì)酸，不具備促進(jìn)干細(xì)胞黏附、增殖、分化的能力。

脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)是脂肪組織去掉細(xì)胞后剩余部分，主要成分包括膠原蛋白和VEGF、GAG等多種生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞黏附、增殖、成脂分化。但是脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)為絮狀結(jié)構(gòu)，難以制備為載體。微流控芯片可以在微觀尺度上操作液體，利用液體剪切力可制備大小成分均一的液滴。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法，該方法能夠生產(chǎn)大小、成分均一的脫細(xì)胞基質(zhì)微載體，可用于于脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：所述一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)制備：

a.取人脂肪組織置于-80℃條件下冰凍20～40分鐘，然后取出，在室溫下靜置至完全解凍，如此反復(fù)凍融3～5個(gè)循環(huán)；

b.將步驟a中反復(fù)凍融后的脂肪離心后去除最上層油和最下層水，取中間層并加入生理鹽水洗滌后離心后去除生理鹽水洗滌液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后離心去除消化液，再加入異丙醇在37℃下浸泡48～60h后離心去除異丙醇，最后用生理鹽水重復(fù)洗滌3～5次，每次加入生理鹽水混勻洗滌后離心去除生理鹽水洗滌液；

c.將步驟b中浸泡洗滌后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后離心去除混合酶溶液，并加入生理鹽水重復(fù)洗滌3～5次，每次加入生理鹽水混勻洗滌并離心去除生理鹽水洗滌液；其中所述混合酶溶液是由以下比例的物質(zhì)配制而成：55mmol/L Na₂HPO4、17mmol/L KH₂PO4、4.9mmol/L MgSO₄·7H₂O、15000U DNase、12.5mg Rnase、2000UI I型脂肪酶；

d.將步驟c中混合酶浸泡洗滌后的脂肪再次加入異丙醇在37℃下浸泡6～10h后離心去除異丙醇，最后采用生理鹽水混勻洗滌后離心去除生理鹽水洗滌液得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)；

(2)脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)溶液制備：將步驟(1)中制備的脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)采用重量體積比為0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，離心去除α-淀粉酶水溶液，再將脫細(xì)胞基質(zhì)放入濃度為0.2mol/L的醋酸中，并勻漿，使脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量體積為0.1％～3％，得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)溶液；