[發(fā)明專(zhuān)利]一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910132697.0
• 申請(qǐng)日: 2019-02-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109675111B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張馨月;汪振星;孫家明;周牧冉;羅超;陳靂風(fēng);曾宇陽(yáng);侯金飛;牟珊;黎媛;方慧敏;王冰倩;齊鈺涵;張郭
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/08;A61L27/24;A61L27/50
• 代理公司: 武漢楚天專(zhuān)利事務(wù)所 42113
• 代理人: 楊宣仙

1.一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)制備：

a.取人脂肪組織置于-80℃條件下冰凍20～40分鐘，然后取出，在室溫下靜置至完全解凍，如此反復(fù)凍融3～5個(gè)循環(huán)；

b.將步驟a中反復(fù)凍融后的脂肪離心后去除最上層油和最下層水，取中間層并加入生理鹽水洗滌后離心后去除生理鹽水洗滌液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后離心去除消化液，再加入異丙醇在37℃下浸泡48～60h后離心去除異丙醇，最后用生理鹽水重復(fù)洗滌3～5次，每次加入生理鹽水混勻洗滌后離心去除生理鹽水洗滌液；

c.將步驟b中浸泡洗滌后的脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后離心去除混合酶溶液，并加入生理鹽水重復(fù)洗滌3～5次，每次加入生理鹽水混勻洗滌并離心去除生理鹽水洗滌液；其中所述混合酶溶液是由以下比例的物質(zhì)配制而成：55mmol/L Na₂HPO4、17mmol/L KH₂PO4、4.9mmol/L MgSO₄·7H₂O、15000U DNase、12.5mg Rnase、2000UI I型脂肪酶；

d.將步驟c中混合酶浸泡洗滌后的脂肪再次加入異丙醇在37℃下浸泡6～10h后離心去除異丙醇，最后采用生理鹽水混勻洗滌后離心去除生理鹽水洗滌液得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)；

(2)脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)溶液制備：將步驟(1)中制備的脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)采用重量體積比為0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，離心去除α-淀粉酶水溶液，再將脫細(xì)胞基質(zhì)放入濃度為0.2mol/L的醋酸溶液中，并勻漿，使脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量體積為0.1％～3％，得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)溶液；

(3)制作毛細(xì)管微流控芯片：將內(nèi)徑100～400um和500～1000um的玻璃毛細(xì)管嵌套0.5～5cm，并將嵌套后的兩根玻璃毛細(xì)管固定在載玻片上，其固定后內(nèi)層毛細(xì)管兩端及外層毛細(xì)管與內(nèi)層毛細(xì)管嵌套一端均置于載玻片上，外層毛細(xì)管未嵌套一端伸出載玻片，并在內(nèi)層毛細(xì)管未嵌套端以及外層毛細(xì)管與內(nèi)層毛細(xì)管嵌套端分別倒扣加樣槍槍頭，加樣槍槍頭底部邊緣與載玻片密封連接，且連接后其兩個(gè)加樣槍槍頭倒扣區(qū)域分別形成一個(gè)與內(nèi)層毛細(xì)管連通的第一密封腔和一個(gè)與外層毛細(xì)管連通的第二密封腔，制成微流控芯片；

(4)制備膠原蛋白-氧化石墨烯溶液：將膠原蛋白和氧化石墨烯加入0.1mol/L的醋酸溶液中配制含有濃度1％w/v～4％w/v膠原蛋白、0.01～0.4％w/v氧化石墨烯的混合溶液，用超聲細(xì)胞破碎器以30％強(qiáng)度、超聲時(shí)間1～3s、間歇時(shí)間1～3s進(jìn)行超聲混勻，得到均勻的膠原蛋白-氧化石墨烯溶液；

(5)將步驟(2)中的制備的脫細(xì)胞基質(zhì)溶液與步驟(4)中配制的膠原蛋白-氧化石墨烯溶液按1:1～1:10的比例混合置于注射器中，用軟管連接到微流控芯片上與內(nèi)層毛細(xì)管相連的槍頭開(kāi)口端；將span-80與純正癸醇混合后的溶液，其中span-80的質(zhì)量體積比為5％，置于注射器中，用軟管連接到微流控芯片上與外層毛細(xì)管相連的槍頭開(kāi)口端；并調(diào)節(jié)流速使得脫細(xì)胞基質(zhì)-膠原蛋白-氧化石墨烯混合溶液與正癸醇溶液流速比為1:1～1:20，獲得包裹有正癸醇的脫細(xì)胞基質(zhì)-膠原蛋白-氧化石墨烯液滴；

(6)將NaCl、EDC、NHS、Tween20加入0.05mol/L的pH 8.0的Tris-HCl的溶液中，配制NaCl的質(zhì)量體積比為5％，EDC濃度為5mg/ml，NHS的濃度為2mg/ml，Tween20的體積分?jǐn)?shù)為5％的交聯(lián)液；將步驟(4)中獲得的包裹有正癸醇的脫細(xì)胞基質(zhì)-膠原蛋白-氧化石墨烯液滴通入上述交聯(lián)液中靜置16～24h后，去除交聯(lián)液收集微載體，并洗滌后得到膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡、異丙醇浸泡、混合酶溶液浸泡以及生理鹽水洗滌時(shí)，每種浸泡液和洗滌液分別與脂肪的體積質(zhì)量比為1:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)微載體的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中處理后得到脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)浸泡保存在溫度為4℃、濃度為75％的酒精中。