[發明專利]一種利用RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物及試劑盒與檢測方法

在審

• 申請號: 201910125246.4
• 申請日: 2019-02-20
• 公開（公告）號: CN109735659A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 沈懷舜;臧亞南;胡亞成;徐增洪;水燕
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫昱

本發明公開了一種利用RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物及試劑盒與檢測方法，其中所述RPA檢測的引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物對，用于檢測或輔助檢測克氏原螯蝦小RNA病毒。以該引物對克氏原螯蝦待測樣本進行檢測，若RPA擴增產物含有大小為151bp的片段，則所述待測克氏原螯蝦中含有小RNA病毒。檢測方法包括引物合成、待測樣品中RNA的提取、反轉錄、RPA擴增及擴增產物分析等步驟，該檢測方法操作簡單，穩定性好，為有效檢測和鑒定克氏原螯蝦小RNA病毒提供一種成本低、快速、特異的現場診斷方法。

技術領域

本發明屬于水產動物病毒的分子檢測技術領域，涉及到一種利用重組酶介導等溫擴增技術檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的方法以及檢測專用引物。

背景技術

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，俗稱小龍蝦，隸屬于節肢動物門、甲殼綱、原螯蝦屬。原產于美國南部和墨西哥北部，后由日本引進入中國。由于其較高的營養價值及其獨特的風味，目前已成為一種重要淡水經濟水生動物，是我國水產增養殖的重要對象。

然而近年來，隨著克氏原螯蝦人工養殖面積的不斷擴大，克氏原螯蝦病害頻發，導致產量降低，品質下滑，農戶受損嚴重，其中，以克氏原螯蝦“五月瘟”，或稱“五月魔咒”，最為嚴重。目前，有關克氏原螯蝦“五月瘟”病原的研究報道并不多，一般認為白斑綜合征病毒（WSSV）是引起“五月瘟”的主要病原。在對克氏原螯蝦“五月瘟”病原研究過程中，我們新發現了一種小RNA病毒，此病毒與“五月瘟”密切相關，可能是導致克氏原螯蝦“五月瘟”的另一重要病原。

小RNA病毒（Picornaviridae）為22～30納米的二十面體，無包膜，基因組為連續線型單鏈RNA。大多數已知的小RNA病毒常感染哺乳動物和鳥類，但也有一些在兩棲動物、節肢動物和水產魚類中檢測到。感染此病毒可引起中樞神經系統、心臟、肝臟、皮膚、胃腸道或上呼吸道疾病。目前，蝦蟹病毒病尚無有效的治療方法，病毒的早期準確檢測對疾病的預防和控制尤為重要，因此建立一種簡便、快速、靈敏、準確的病毒檢測方法對病毒病的防控具有重要意義。

目前應用較多病毒檢測方法有聚合酶鏈式反應(PCR)、巢式PCR和熒光定量PCR等技術。但這些方法均需要昂貴的PCR儀或特殊儀器設備和專業的試驗場地，同時 PCR擴增的過程，需要有特殊的熱循環設備、低溫保 存的試劑和避免交叉污染的技術操作要求, 且操作復雜繁瑣、耗時長，時效性低，同時也需要具有一定分子生物學基礎及操作技術診斷的需求限制了PCR在現場診斷中的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物及試劑盒與檢測方法，以建立克氏原螯蝦小RNA病毒的快速檢測方法。

本發明的技術方案如下：

本發明首先針對克氏原螯蝦小RNA病毒的基因保守區域提供了一對用于RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物：

RPA PcPV-1F:5’-CTGATGAGGAATTAGACGATCTTATCGTTG-3'；（SEQ ID NO.1）

RPA PcPV-1R:5’-CAGAATTAAAGACCGACGTTAGTAGATGAC-3'。（SEQ ID NO.2）

本發明又提供了一種利用RPA檢測或輔助檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的試劑盒，該試劑盒包括以上SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物。

進一步地，該試劑盒還可以包括Rehydration Buffer，ddH₂O和醋酸鎂溶液。

其中所述醋酸鎂溶液的濃度可以為280 mM。

本發明又提供了一種基于上述試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：