[發(fā)明專利]一種利用RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物及試劑盒與檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910125246.4
• 申請日: 2019-02-20
• 公開（公告）號: CN109735659A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發(fā)明（設計）人: 沈懷舜;臧亞南;胡亞成;徐增洪;水燕
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫昱

1. 一種利用RPA檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.權利要求1所述的引物對在檢測或輔助檢測克氏原螯蝦小RNA病毒中的應用。

3.一種利用RPA檢測或輔助檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權利要求1所述的引物對。

4. 根據權利要3所述的試劑盒，其特征在于，還包括Rehydration Buffer，ddH₂O和醋酸鎂溶液。

5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述醋酸鎂溶液的濃度為280 mM。

6.權利要求4所述的試劑盒檢測克氏原螯蝦小RNA病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，從待測克氏原螯蝦上提取病毒RNA，并反轉錄成cDNA備用；

步驟二，以步驟一得到的cDNA為模板，SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2為引物進行RPA擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RPA擴增產物大??；

步驟三，對檢測結果進行判定，如RPA擴增產物含有大小為151bp的片段，則所述待測克氏原螯蝦中含有小RNA病毒，反之則不含有小RNA病毒。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟二中RPA擴增包括以下步驟：

步驟1，配制47.8μl的混合反應液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10 μM的上游引物2.4μl，10 μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和 ddH₂O 12.5μl；

步驟2，將混合反應液混勻后轉移至含有凍干酶粉的反應單元管中，用移液槍混勻，使管中顆粒全部懸浮，加入280 mM 醋酸鎂溶液2.5μl，蓋上管蓋，快速混勻，37℃反應4min，4min結束后，取出，劇烈翻轉8-10次，混勻，重新放入金屬浴上反應30min。

8.權利要求3-5任一項所述的試劑盒在檢測或輔助檢測克氏原螯蝦小RNA病毒中的應用。