[發明專利]一種高結瘤固氮植物的培育方法

在審

• 申請號: 201910122103.8
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109735561A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 紀洪濤;李霞;王延旭;王倩
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 石家莊輕拓知識產權代理事務所(普通合伙) 13128
• 代理人: 張培元

本發明公開了一種高結瘤固氮植物的培育方法，在植物體內分別過表達或者同時過表達序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，獲得與正常植物相比具有高結瘤固氮能力的轉基因植物。利用本發明構建的過表達載體轉化受體大豆植株獲得轉基因植物，能夠顯著提高大豆的根瘤數目，對減少氮肥施用和提高大豆產量具有重大的意義。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及到大豆鈣調素蛋白家族GmCaM7編碼基因促進大豆根瘤數目的應用方法。

背景技術

大豆是重要的糧油經濟作物，其特有的共生固氮能力可將空氣中的氮氣轉化為可被植物吸收利用的氨態氮，為自身生長發育提供了必需的氮素營養。充分利用大豆根瘤介導的共生固氮過程，不僅對維系大豆的正常生長和產量具有重要作用，并且還利于減少施肥過多帶來的環境污染，因而，挖掘和提高大豆共生固氮效率已成為農業可持續發展的重要途徑之一。

根瘤是共生固氮的場所，根瘤的數目決定著共生固氮的效率，較多的具有固氮功能的根瘤數目能夠顯著提高N₂的固定效率，然而過多的根瘤數目也會影響植株的正常發育，因而豆類植物演化出了調節根瘤數目的機制，它們能夠感知自身對氮素營養的需求，在不影響自身生長發育情況下保證氮素營養的生產和利用。

目前對根瘤數目調控的分子機制的研究主要集中在受體激酶介導的結瘤自調控信號通路（Autoregulation signaling pathway，AON）上，AON信號通路包括兩個長距離運輸信號（根起源的信號和葉起源的信號）。在根瘤原基形成的同時（根瘤菌侵染根毛后的3-5天），在根部產生一些可移動的信號肽分子CLAVATA3/endosperm surrounding region（CLE），CLE含有12-13個氨基酸，通過木質部運輸至葉薄壁組織，與質膜上的LRR-RLK（Lucine rich repeat-Receptor like kinase）受體類激酶受體結合，開啟結瘤自調控信號，并誘導一類被稱為SDI（Shoot Derived Inhibitors）的物質從地上部分運至根中，抑制根系結瘤（Okamoto et al., 2013）。在百脈根中，兩個來自根中產生的CLE多肽CLE-RS1和CLE-RS2被質膜上的LRR-RLK受體類激酶HAR1 (Hypernodulation Aberrant Rootformation1)識別，進而組成多肽-受體復合體發揮抑制根瘤數目的作用（Nishimura etal., 2002）。此外，在百脈根中又鑒定一個在根部發揮作用的超結瘤突變體tml(Too MuchLove)，研究發現地上的HAR1和地下的TML共同調控根瘤數目（Magori et al., 2009）；在苜蓿和大豆中也都發現了CLE受體，苜蓿的MtSUNN、大豆中GmNARK和百脈根的HAR1都是擬南芥atCLV1（CLAVATA 1）的同源蛋白，但是在豆科植物中分化出調節根瘤數目的功能（Nishimura et al., 2002; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005; Mirzaeiet al., 2017）。

植物中的Ca²⁺結合蛋白很多，通過EF-hand結構域與Ca²⁺結合，如擬南芥中有大約250 種蛋白質包含結合Ca2⁺的EF-h1nd結構域（Day et al 2002）；在大豆中也有至少262個基因編碼含有EF-hand結構域的蛋白質(Zeng et al 2017)。鈣調素（Calmodulin，CaM）是其中一種Ca²⁺結合蛋白，也稱為Ca2⁺傳感器，擬南芥中有7個基因編碼CaMs類蛋白，這類蛋白通過4 個EF-hand構象結合4 個Ca2⁺，參與調控眾多類似轉錄和酶活性的重要生理過程。在大豆基因組中包括6種鈣調素(CaMs)，這些鈣調素家組蛋白在大豆根瘤數目調控的研究并未報道。相關的參考文獻如下。