[發明專利]靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA、siRNA質粒、慢病毒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201910116979.1
• 申請日: 2019-02-13
• 公開（公告）號: CN109868274A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 吳帆;王百林;嚴倫;戴麗冰
• 申請（專利權）人: 廣州市紅十字會醫院（暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 李玉峰

本發明公開了一種靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA、siRNA質粒、慢病毒及其構建方法和在制備肝癌治療藥物中的應用，通過研究EGFL9在肝癌組織中的表達水平，為肝癌的治療提供了EGFL9基因這一作用靶點；通過設計靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA序列、以及相應的siRNA表達質粒和siRNA慢病毒，從而能夠高效抑制肝癌細胞中EGFL9基因的表達，并因此能夠有效抑制肝癌細胞的侵襲遷移能力，對于肝癌的EGFL9基因靶向治療藥物的制備意義重大；同時可用于相應RNAi、單克隆抗體及小分子拮抗劑等靶向治療藥物的開發，從而為針對EGFL9開發治療肝癌的靶向治療藥物提供了一種行之有效的方法。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA、siRNA質粒、干擾慢病毒及其構建方法和在制備肝癌治療藥物中的應用。

背景技術

肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC；簡稱肝癌)現居我國惡性腫瘤發病率的第四位，其年死亡率已達23.31/10萬，高居國內惡性腫瘤死亡率的第二位，嚴重威脅我國人民的生命健康。盡管近年來肝癌手術切除率已明顯提高，肝癌的治療手段已趨于多樣化，肝移植也越來越多地用于肝癌的治療，但肝癌的整體治療水平目前仍無顯著改善，術后5年生存率長期徘徊在30％左右。究其原因，主要在于肝癌術后極高的復發轉移率。目前，肝癌術后5年內的復發/轉移率仍高達70～80％，嚴重地制約著肝癌遠期生存率的提高。因此，侵襲轉移的調控機制一直都是肝癌研究的重點之一。

累積的研究顯示，肝癌的侵襲轉移是一個多步驟、序貫的生物學過程，牽涉到許多復雜的生物學、病理學事件，包括腫瘤細胞的脫落、運動遷移、細胞粘附、血管生成及免疫逃逸等諸多環節，但細胞侵襲遷移能力的提高是導致腫瘤突破內皮細胞屏障并發生遠處轉移的關鍵環節，故而已有大量研究都集中于肝癌細胞侵襲遷移能力的調控。然而，目前的研究仍未完全闡明調控肝癌細胞侵襲遷移的分子機制，因而尚未開發出可有效抑制肝癌復發轉移的藥物，從而嚴重制約了肝癌病人長期生存率的進一步提高。可見，繼續尋找在肝癌侵襲遷移中發揮重要作用的分子并闡明其作用機制，對于研發抑制肝癌復發轉移的靶向治療措施均非常重要。

EGFL9基因(表皮生長因子樣9結構域，又稱DLK2)屬于EGFL家族成員，其定位于人染色體6p21.1，大小為6,281bp。EGFL9基因編碼的蛋白大小為40.5kDa，屬于跨膜糖蛋白，在人體組織中有著范圍較廣的表達譜，在肺臟、大腦、脂肪、睪丸、成人肝臟、胎盤、卵巢和胸腺組織中都有表達。早期的研究顯示，EGFL9在脂質生成過程中發揮重要作用。近來的研究則發現，EGFL9基因的突變與進展期前列腺癌相關，這首次提示EGFL9可能參與惡性腫瘤的發生發展過程。還有研究發現 EGFL9可通過抑制Notch1信號通路從而抑制SK-MEL-2轉移性黑色素瘤細胞的增殖，最新的研究還發現，針對小鼠EGFL9(DLK2)的疫苗可以降低小鼠模型中腎癌的生長，提示EGFL9是一個潛在的腫瘤治療靶點。然而迄今為止，EGFL9在肝癌等惡性腫瘤中的表達水平及其在惡性腫瘤侵襲轉移過程中的作用均尚無任何研究報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA、siRNA質粒、干擾慢病毒及其構建方法和在制備肝癌治療藥物中的應用，通過研究EGFL9在肝癌組織中的表達水平、設計人EGFL9基因的siRNA序列，并構建相應的siRNA質粒和干擾慢病毒，以慢病毒介導siRNA的方法，特異性抑制肝癌細胞中EGFL9基因的表達，從而實現抑制肝癌細胞侵襲轉移的作用。