[發明專利]靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA、siRNA質粒、慢病毒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201910116979.1
• 申請日: 2019-02-13
• 公開（公告）號: CN109868274A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 吳帆;王百林;嚴倫;戴麗冰
• 申請（專利權）人: 廣州市紅十字會醫院（暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 李玉峰

1.一種靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA，其特征在于：所述siRNA序列為5’-CTGTGAGGTAAATGTGGATGA-3’(序列1)。

2.一種靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA質粒，其特征在于：包括含有權利要求1所述siRNA序列的雙鏈DNA oligo；所述雙鏈DNA oligo的正義鏈序列為5’-CCGGCTGTGAGGTAAATGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACATTTACCTCACAGTTTTTG-3’(序列2)，反義鏈序列為5’-AATTCAAAAAGGTGGCAAGACCTGTGAGCTTTCTCTTGAAAAGCTCACAGGTCTTGCCACC-3’(序列3)，其兩端含有Age I和EcoR I酶切位點粘端。

3.一種靶向抑制EGFL9基因表達的干擾慢病毒，其特征在于：包括權利要求2所述siRNA質粒以及慢病毒包裝載體。

4.權利要求3所述靶向抑制EGFL9基因表達的干擾慢病毒的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)siRNA質粒的構建

(1-1)以Age I和EcoR I限制性內切酶作用于GV248載體以使其線性化，電泳鑒定其酶切片段，得到線性化的GV248質粒；

(1-2)通過T4 DNA連接酶將所述線性化的GV248質粒和純化好的權利要求2所述雙鏈DNAoligo連接，得到連接產物；將連接產物轉化到感受態大腸桿菌細胞，以連接轉化產物長出菌溶于LB培養基作為模板進行PCR鑒定；

(1-3)PCR鑒定采用的引物為：

上游：5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’(序列4)；

下游：5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’(序列5)；

對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構建成功的含有EGFL9干擾片段的siRNA質粒；

(2)干擾慢病毒的構建

以所述siRNA質粒作為表達載體，Helper 1.0和Helper 2.0慢病毒包裝輔助質粒作為慢病毒包裝載體，同時共轉染293T細胞，在該細胞中進行病毒的包裝并分泌到細胞外的培養基中，收集培養基離心后取得的上清液，即為包含所述siRNA質粒的干擾慢病毒。

5.權利要求1所述靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA在制備肝癌治療藥物中的應用。

6.權利要求2所述靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA質粒在制備肝癌治療藥物中的應用。

7.權利要求3所述靶向抑制EGFL9基因表達的干擾慢病毒在制備肝癌治療藥物中的應用。

8.一種藥物組合物，其特征在于包括權利要求1所述的靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA。

9.一種藥物組合物，其特征在于包括權利要求2所述的靶向抑制EGFL9基因表達的siRNA質粒。

10.一種藥物組合物，其特征在于包括權利要求3所述的靶向抑制EGFL9基因表達的干擾慢病毒。