[發明專利]一種基于孔板技術的紅曲霉分離純化方法

在審

• 申請號: 201910116434.0
• 申請日: 2019-02-15
• 公開（公告）號: CN109593660A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 倪莉;周康熙;劉志彬;張雯;張晨
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

本發明提供了一種基于孔板技術的紅曲霉分離純化方法，在裝有酸醇米粉培養基的六孔板中對紅曲霉進行擴培，而后在裝有PDA的六孔板中進行涂布，提取形態各異的菌落進行24孔板點樣復檢。本發明所述的分離純化方法，一方面極大地抑制了除紅曲霉以外的大部分微生物的生長，減輕了雜菌的干擾，縮短了實驗周期；另一方面基于孔板進行操作，其工作效率相比于傳統的搖瓶?平板體系顯著提高，減少了工作量，能夠更快地獲得紅曲霉。

技術領域

本發明屬于紅曲霉分離純化技術領域，具體涉及一種基于孔板技術的紅曲霉分離純化方法。

背景技術

紅曲霉是一種紅曲黃酒釀造用菌，工業中也有應用紅曲霉進行生產紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角固醇的實例，可見紅曲霉具有很大的實用價值。

目前紅曲霉主要由紅曲分離純化而得。盡管紅曲霉是紅曲的優勢菌，但紅曲中還有其他微生物：酵母菌、青霉、黑曲霉、根霉菌、乳酸菌等，這使得紅曲霉的分離純化較為困難。

有些學者在對紅曲霉進行分離純化時，在真菌培養基中加入了抗生素以抑制細菌的生長，然而該培養配方難以避免其他真菌對紅曲霉的干擾；有些學者在分離純化培養基中加入了脫氧膽酸鈉以抑制真菌菌絲體的蔓延，以此來減輕其他真菌對紅曲霉的抑制，但此方法同樣也抑制了紅曲霉的生長。此外，傳統的分離純化操作基本以來搖瓶或平板，工作量大、試劑耗費也大，而若使用孔板來進行操作，則大大提高了工作效率。

為了既滿足紅曲霉的生長，又要抑制其他大部分微生物的干擾，本發明利用紅曲霉耐受酒精、嗜好乳酸、易染大米的特性進行培養基的配置，而大部分微生物難以同時耐受乳酸和酒精而受到抑制，可以達到紅曲霉分離純化的目的。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術不足，提供一種基于孔板技術的紅曲霉分離純化方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于孔板技術的紅曲霉分離純化方法：將0.5~2.0g待分離樣品分別加至每孔裝有20~30mL液體酸醇米粉培養基的深六孔板中進行紅曲霉擴培，30℃、200r/min擴培3d后在無菌超凈臺內各取100uL樣品在PDA上進行涂布，30℃培養5d后挑取形態各異的菌落在含有鑒定培養基的24孔板中進行點樣復檢，24孔板第一至四行每行分別加1.5mL的CYA、G25N、MEA、PDA培養基，最后將復檢后的紅曲霉菌株在PDA斜面培養基上劃線培養后4℃保藏。

其中，液體酸醇米粉培養基的配置方法為：無水葡萄糖5~15g、過40目的秈米粉15~30g、乳酸8~12mL，加去離子水定容至950mL，121℃滅菌20min。滅菌后再在無菌超凈臺中加入50mL無水乙醇，混勻，分裝于深六孔板中。

PDA培養基的具體配置方法為：馬鈴薯削皮切塊，取200g塊狀馬鈴薯加蒸餾水800mL沸水蒸煮20~30min，用八層紗布過濾殘渣，取濾液加20g葡萄糖和17~20g瓊脂，煮沸冷卻后定容至1L,121℃20min滅菌。

CYA培養基的配置方法為：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、氯化鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.5g、七水合硫酸亞鐵0.01g、酵母提取粉5.0g、蔗糖30g、17~20g瓊脂，定容至1L后121℃20min滅菌。

G25N培養基的配置方法為：CYA培養基中加入25wt.%的甘油。

MEA培養基的配置方法為：酵母提取粉20g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、17~20g瓊脂，定容至1L后121℃20min滅菌。

本發明的有益效果在于：

（1）以深六孔板替代搖瓶、以淺六孔板替代平板，不僅節省培養基原料，而且搖床及培養基的使用效率提高了6倍，減少了操作的工作量，增加了同批次可分離純化的樣品數；