[發明專利]抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201910116392.0
• 申請日: 2019-02-15
• 公開（公告）號: CN109750119A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 黃兆峰;魏守輝;黃紅娟;張朝賢;周欣欣;姜翠蘭
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測方法及試劑盒。本發明提供與鼠尾看麥娘ALS抑制劑類除草劑抗性相關的特異性DNA片段及用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的特異性引物對，所述特異性DNA片段包括如SEQ ID NO.1所示的DNA片段在122位由丙氨酸突變為蘇氨酸、或在197位由脯氨酸突變為蘇氨酸，或在205位由丙氨酸突變為纈氨酸、或在376位由天冬氨酸突變為谷氨酸，或在574位由色氨酸突變為亮氨酸，或在653位由絲氨酸突變為天冬酰胺，或在654位由絲氨酸突變為酪氨酸。本發明的檢測方法具有操作簡便，速度快、成本低、準確度高等優勢，適于推廣應用。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測方法及試劑盒。

背景技術

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase，簡稱ALS，EC 2.2.1.6)，是合成支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)的關鍵酶。ALS抑制劑類除草劑是以ALS酶為靶標的除草劑。該類除草劑噴施到雜草后，雜草ALS酶的活性被抑制，支鏈氨基酸合成受阻，最終導致植株死亡。由于具有高效、低毒、對環境污染小等優點，該類除草劑迅速成為全球應用最為廣泛和最重要的除草劑之一。目前，全球已開發ALS抑制劑類除草劑56種，位于不同類型除草劑之首。在中國，廣泛用于小麥田雜草防除的ALS抑制劑類除草劑主要有：苯磺隆，甲基二磺隆，啶磺草胺，雙氟磺草胺等。

近幾年來，河南、山東部分地區出現啶磺草胺等ALS抑制劑類除草劑對小麥田鼠尾看麥娘防治效果不明顯、田間劑量已無法有效將其殺死的問題，并且發現有些鼠尾看麥娘種群對甲基二磺隆等ALS抑制劑類除草劑也產生了交互抗性。由于對抗藥性雜草的認知不足，農民盲目加大藥劑使用量，既增加用藥成本，又加大藥害風險，并且會導致更多抗性雜草的出現與發展，嚴重影響農藥減量使用以及糧食增產、農民增收和國家糧食安全。因此，開發一種快速、簡便易操作的抗藥性雜草檢測方法十分迫切。

傳統的抗藥性雜草檢測方法通常需要到田間采集疑似抗性雜草的種子，催芽后播種在培養盆中，培養一定葉齡后噴施系列劑量的除草劑，繼續培養一段時間，剪取地上部分稱鮮重或烘干稱干重后計算抑制中濃度和抗藥性指數。此方法直觀性強，能客觀評價雜草抗性水平。但也有局限性，主要表現在：一是需建立植物培養室，并且培養雜草和檢測周期長；二是不能從微觀分子角度解釋其抗性機制，不能用于指導科學用藥以防止抗藥性種群的發展。隨著分子生物學技術在雜草抗藥性機制方面的應用與發展，越來越多的抗藥性雜草被發現，抗藥性機制被明確。研究表明，植物體ALS 8個氨基酸(以擬南芥ALS為標準標注位點Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654)任何一個位點發生突變，均可導致對ALS抑制劑產生抗性。在歐洲，抗性鼠尾看麥娘ALS在197位由脯氨酸突變為蘇氨酸已被發現，但其他位點氨基酸突變未見報道。因此，鼠尾看麥娘是否產生抗藥性可以通過測定靶標ALS基因保守區的突變位點來確定。

發明內容

為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的是提供抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測方法及試劑盒。

為了實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：本發明通過結合軟件設計和大量的人工優化設計篩選，獲得2對具有較高擴增效率和特異性的引物對，對不同農田采集的對ALS抑制劑具有不同抗性的鼠尾看麥娘進行PCR擴增和擴增產物的測序分析，通過對抗性鼠尾看麥娘和敏感鼠尾看麥娘的ALS基因序列進行比對分析，發現鼠尾看麥娘中導致ALS抑制劑類除草劑抗性的ALS突變位點。

本發明首先提供與鼠尾看麥娘ALS抑制劑類除草劑抗藥性相關的特異性DNA片段，所述特異性DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段編碼氨基酸的122位由丙氨酸突變為蘇氨酸、或在197位由脯氨酸突變為蘇氨酸，或在205位由丙氨酸突變為纈氨酸、或在376位由天冬氨酸突變為谷氨酸，或在574位由色氨酸突變為亮氨酸，或在653位由絲氨酸突變為天冬酰胺，或在654位由絲氨酸突變為酪氨酸。