[發(fā)明專利]抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測(cè)方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910116392.0
• 申請(qǐng)日: 2019-02-15
• 公開（公告）號(hào): CN109750119A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃兆峰;魏守輝;黃紅娟;張朝賢;周欣欣;姜翠蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.與鼠尾看麥娘ALS抑制劑類除草劑抗藥性相關(guān)的特異性DNA片段，其特征在于，所述特異性DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段編碼的氨基酸的第122位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，或在197位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，或在205位由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，或在376位由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔蛟?74位由色氨酸突變?yōu)榱涟彼幔蛟?53位由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚蛟?54位由絲氨酸突變?yōu)槔野彼帷?/p>

2.用于檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的特異性引物對(duì)，其特征在于，包括引物對(duì)1和/或引物對(duì)2；所述引物對(duì)1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示，所述引物對(duì)2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。

3.包含權(quán)利要求2所述特異性引物對(duì)的試劑盒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、Mg²⁺、DNA聚合酶中的一種或多種。

5.權(quán)利要求2所述特異性引物對(duì)或權(quán)利要求3或4所述試劑盒在檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘或指導(dǎo)農(nóng)田除草用藥中的應(yīng)用。

6.一種抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的檢測(cè)方法，其特征在于，以待測(cè)鼠尾看麥娘樣品的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的特異性引物對(duì)或權(quán)利要求3或4所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94～98℃預(yù)變性2～5min，94～98℃變性10～30s，55～60℃退火10～30s，72℃延伸10～60s，循環(huán)25～40次，72℃延伸2～10min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，當(dāng)采用所述引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次，72℃延伸5min；

當(dāng)采用所述引物對(duì)2進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次，72℃延伸5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的50μL反應(yīng)體系如下：10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，2.5mM dNTPs 2μL，引物混合液2μL，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA2μL，雙蒸水補(bǔ)至50μL；

所述引物混合液包括引物對(duì)1和/或引物對(duì)2；所述引物混合液中，各引物對(duì)的正向引物和反向引物的摩爾比為1：1。

10.根據(jù)權(quán)利要求6～9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為采用測(cè)序分析，所述抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：若所述待測(cè)鼠尾看麥娘樣品的擴(kuò)增片段的第122位由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，或在197位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，或在205位由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，或在376位由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔蛟?74位由色氨酸突變?yōu)榱涟彼幔蛟?53位由絲氨酸突變?yōu)樘於０罚蛟?54位由絲氨酸突變?yōu)槔野彼?以擬南芥ALS氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn))，則所述待測(cè)鼠尾看麥娘為抗ALS抑制劑類除草劑鼠尾看麥娘。