[發(fā)明專利]一種檢測CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910115862.1
• 申請日: 2019-02-15
• 公開（公告）號: CN109971842A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧濤;李倩;王越;喻堃;盧鈾
• 申請（專利權(quán)）人: 成都美杰賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發(fā)明公開了一種檢測CRISPR?Cas9脫靶效應(yīng)的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，其步驟包括：a.采用軟件預(yù)測sgRNA的脫靶位點，并獲得PCR擴增引物；b.選取基因樣本，所選基因樣本包括基因編輯樣本和未進行基因編輯樣本；c.PCR擴增預(yù)測出的脫靶位點；d.對PCR產(chǎn)物進行高通量測序；e.結(jié)果分析，序列比對；本發(fā)明根據(jù)指定的比對規(guī)則，將所述基因編輯后的樣本與未進行基因編輯的對照樣本進行比對，而不僅僅和數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，也不需要獲得子代或親本樣本基因信息，實現(xiàn)個性化的找尋細(xì)胞基因組上的可能脫靶位點，提高脫靶檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度，從而提高了基因編輯的安全性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的方法。

背景技術(shù)

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系統(tǒng)是近年來研發(fā)成功的一種基因編輯系統(tǒng)，是一種細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)。由于操作簡單，快捷高效等優(yōu)點，來源于釀膿鏈球菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛運用于基因工程。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括了Cas9，crRNA和tracrRNA，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程中，Cas9蛋白、crRNA及tracrRNA首先結(jié)合形成復(fù)合物，識別并結(jié)合crRNA的互補序列，隨后Cas9蛋白的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，Ruvc活性位點剪切非互補鏈，使DNA雙鏈斷裂，實現(xiàn)對DNA的定點編輯。

然而，研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，即切割與靶向序列相類似的非靶點區(qū)域DNA序列。脫靶效應(yīng)的發(fā)生可能會破壞非目標(biāo)基因的功能，例如原癌基因和腫瘤抑制基因，甚至是大范圍基因重組。這一缺點嚴(yán)重限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運用。

目前，脫靶檢測的方法主要有T7EN1酶切法，IDLV法，GUIDE-seq技術(shù)和Digenome-seq技術(shù)等，這些方法各具優(yōu)缺點：

T7EN1酶切法操作最簡單，耗時最短，但靈敏度太低，只能檢出脫靶率較高的位點；

GUIDE-seq技術(shù)主要是利用一種短雙鏈寡核苷酸標(biāo)簽來標(biāo)記CRISPR/Cas誘導(dǎo)的斷裂(在靶和脫靶)，然后對標(biāo)簽所在的基因區(qū)域進行高通量測序，該方法整個檢測過程時間較長，步驟繁瑣，且不能保證所有的斷裂位點都被標(biāo)記；

而Digenome-seq技術(shù)僅在單細(xì)胞中進行了運用，且同樣存在準(zhǔn)確性不夠高的缺點。

因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確度高、靈敏度高的脫靶檢測方法仍十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于提供一種全新的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的方法，以解決上述問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的：一種檢測CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的方法，其包括以下步驟：

a.預(yù)測sgRNA的脫靶位點，并獲得PCR擴增引物；

b.選取基因樣本，所述基因樣本包括基因編輯樣本和未進行基因編輯樣本；

c.對步驟(a)預(yù)測出的脫靶位點進行PCR擴增；

d.對步驟(c)所得的PCR產(chǎn)物進行高通量測序；

e.結(jié)果分析，序列比對。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案：步驟(a)中，所述預(yù)測sgRNA的脫靶位點的方法為通過軟件或者網(wǎng)站進行預(yù)測。

作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案：所述軟件或者網(wǎng)站選自seqmap，CRISPOR，CRISPRfinder，CRISPR Design，sgRNAcas9，CRISPRdirect，COSMID，Off-Spotter，E-CRISP中的任一。