[發明專利]一種檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法

在審

• 申請號: 201910115862.1
• 申請日: 2019-02-15
• 公開（公告）號: CN109971842A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 鄧濤;李倩;王越;喻堃;盧鈾
• 申請（專利權）人: 成都美杰賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.一種檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于，其包括以下步驟：

a.預測sgRNA的脫靶位點，并獲得PCR擴增引物；

b.選取基因樣本，所述基因樣本包括基因編輯樣本和未進行基因編輯樣本；

c.對步驟(a)預測出的脫靶位點進行PCR擴增；

d.對步驟(c)所得的PCR產物進行高通量測序；

e.結果分析，序列比對。

2.根據權利要求1所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：步驟(a)中，所述預測sgRNA的脫靶位點的方法為通過軟件或者網站進行預測。

3.根據權利要求2所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：所述軟件或者網站選自seqmap，CRISPOR，CRISPR finder，CRISPR Design，sgRNAcas9，CRISPRdirect，COSMID，Off-Spotter，E-CRISP中的任一。

4.根據權利要求2所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：通過所述軟件或者網站預測的方法為篩選評分最高的至少3條潛在脫靶位點。

5.根據權利要求1所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：步驟(c)中，PCR反應體系為：Transtar taq 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，正向引物1μl(10μM)，反向引物1μl(10μM)，DNA 1μl，無核酸酶水加至25μl；擴增條件：95℃5min,95℃30s，68℃30s(-1℃/循環)，72℃30s，10個循環，95℃30s，58℃30s，72℃30s，25個循環，72℃5min。

6.根據權利要求1所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：步驟(d)中，高通量測序策略包括：純化基因組DNA，打斷基因組DNA，末端修復，3′端加A尾巴，連接索引兩端適配器，validate library and cluster，測序。

7.根據權利要求1所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：步驟(e)中，結果分析的方法為：PCR擴增產物序列通過NCBI在線引物blast獲得，并作為自定義參考基因組；對測序結果原始圖像數據利用軟件CASAVA進行圖像堿基識別，初步質量分析，得到測序樣本的原始數據；使用Cutadapt優化原始數據；使用Pandaseq對優化后的數據進行合并；將合并后的序列與所述自定義參考基因組使用BWA軟件進行比對；再使用samtools檢測SNP/InDel。

8.根據權利要求7所述的檢測CRISPR-Cas9脫靶效應的方法，其特征在于：結果進行初步篩選，過濾條件為基體質量值>20，覆蓋深度>4，映射質量值>40。