[發明專利]一種基于sp2/0細胞永生化改良的雜交瘤技術

在審

• 申請號: 201910109205.6
• 申請日: 2019-02-05
• 公開（公告）號: CN109913500A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 翁炳煥;楊昊堃
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種用于生物領域的基于sp2/0細胞永生化改良的雜交瘤技術，其特征在于，將具有永生化特性的hTERT通過pcDNA3.1?hTERT重組逆轉錄病毒載體轉染鼠sp2/0瘤細胞，獲得永生化特性改良的重組載體包裝鼠sp2/0瘤細胞，進而經細胞篩選和融合將hTERT導入雜交瘤細胞，從而增強雜交瘤細胞的永生化特性，提高了細胞融合的成功率和融合率，增加了克隆篩選過程的細胞成活率，降低了陽性克隆細胞傳代培養中的細胞死亡率，提高了細胞貼壁生長的匯合度，為產業化擴增融合細胞、進而擴增融合細胞內的致病基因奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及生物領域的一種基于sp2/0細胞永生化改良的雜交瘤技術，主要用于科研、制藥和診斷領域的細胞雜交及全基因組的擴增和貯存。

背景技術

雜交瘤技術即淋巴細胞雜交瘤技術，又稱單克隆抗體技術。

克勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)(1975)證明，骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞雜交，形成能分泌針對該抗原的均質的高特異性的抗體--單克隆抗體，這種技術通稱為雜交瘤技術。骨髓瘤細胞在體外可以連續傳代，而脾細胞是終末細胞，不能在體外繁殖。如將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌某種抗體或因子的淋巴細胞雜交，則雜交細胞既具有腫瘤細胞無限繁殖的特性，又具有淋巴細胞能分泌特異性抗體或因子的能力，同時也克服了免疫淋巴細胞不能在體外繁殖的缺點，雜交的細胞稱為淋巴細胞雜交瘤。

建立雜交瘤技術的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內皆會出現明顯的抗體應答反應。雜交細胞的另一方則是為了保持細胞雜交后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加雜交的成功率。多發性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞雜交伴侶。

雜交瘤技術是在細胞融合的基礎上發展起來的，所以雜交瘤技術也稱為細胞融合技術，細胞融合是一個隨機的物理學過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸液中，經雜交后細胞將以多種形式出現。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養基中僅存活5～7d，無需特別篩選;細胞的多聚體形式也容易死去;而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

鑒于細胞DNA合成的兩條途徑，其中的主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經次黃嘌吟磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。細胞融合的選擇培養基中有3種關鍵成分:次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字頭稱為HAT培養基。甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細胞是經毒性培養基選出的HGPRT-細胞株，所以不能在該培養基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養基中長期存活與繁殖。所以可用HAT培養基選擇脾細胞和瘤細胞的有效融合，去除脾細胞和脾細胞、瘤細胞和瘤細胞的無效融合以及未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞、細胞的多聚體等形式的無效融合。

上述的雜交瘤技術或細胞融合技術，是將經過抗原免疫的鼠B細胞與鼠B細胞系惡性腫瘤即多發性骨髓瘤細胞（sp2/0）進行雜交，這種同一體系的細胞可增加雜交的成功率。但如果將其轉用于人基因突變淋巴細胞與鼠sp2/0瘤細胞雜交的雜交瘤細胞的制備，我們發現雖能雜交但存在以下3個問題：（1）人基因突變雜交瘤細胞邊貼壁生長邊漂浮死亡：總有1/2～1/3左右的細胞因死亡而漂浮在培養液中，活細胞貼壁生長的匯合度一般為30～50%，通常不會達到80～90%以上的理想匯合度；（2）罕見病雜交瘤細胞邊貼壁生長邊貼壁死亡：通常會有1/2～1/3左右的細胞貼壁死亡，不會達到80～90%以上的活細胞貼壁生長的理想匯合度。