[發明專利]一種快速的基于Ct值的從多種近似種中鑒別褐飛虱的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201910104550.0
• 申請日: 2019-02-01
• 公開（公告）號: CN109628615A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 劉淑華;唐健;周明好;楊保軍;王愛英;羅舉
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 張曉紅

一種用于鑒定褐飛虱的特異性引物對、質控重組質粒、試劑盒及其檢測方法，屬于害蟲預測預報技術領域。本發明公開了一種用于鑒別褐飛虱的引物對Nl?Its1?F1/Nl?Its1?R1；還公開了用于鑒定褐飛虱的試劑盒及其檢測方法，試劑盒包括2×Reaction Buffer Mix，上述引物對和一個質控重組質粒P；該方法是以粗組織液為定量擴增模板，通過比較樣本與質控質粒Ct值的大小，即可判斷是否為褐飛虱。上述一種用于鑒定褐飛虱的特異性引物對、質控重組質粒、試劑盒及其檢測方法，可直接用于基層植保站對褐飛虱的快速鑒定，對節省人力物力和提高水稻重大害蟲褐飛虱的預測預報準確度具有極為重要的意義。

技術領域

本發明屬于害蟲預測預報技術領域，具體為一種快速的基于Ct值的從多種近似種中鑒別褐飛虱的引物、試劑盒及方法。

背景技術

水稻（Oryza sativa L.）是中國乃至全球最重要的糧食作物之一，其產量和品質直接關系到世界人民的溫飽問題和幸福滿意度。在中國，水稻的產量則直接關系到我國的糧食安全。但水稻受病蟲草為害嚴重，雖經防治仍然造成可觀的經濟損失。褐飛虱[Nilaparvata lugens (St?l)]是亞洲稻區最嚴重的水稻害蟲之一，具遠距離遷飛習性。準確的蟲情預測預報是害蟲防治的關鍵，目前主要采用燈誘監測。測報燈下褐飛虱的始見日、遷入量、遷入峰是褐飛虱預測預報的重要依據，也是褐飛虱防治策略制定的關鍵信息依據。

擬褐飛虱[Nilaparvata bakeri (Muir)]和偽褐飛虱[Nilaparvata muiriChina]是褐飛虱的同屬近似種，并不以水稻為適宜寄主。但它們與褐飛虱具有廣泛的共同分布區域，發生季節也有交叉，且都具有趨光性，對預測預報的準確性造成了嚴重影響。褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱形態非常相似，肉眼難以區分。傳統的形態學鑒定方法，耗時費力，需專業人員借助于顯微鏡才能區分。然而，即使是專業人員，有時對有損標本和若蟲也無能為力。崔亞麗等（2012年）以純DNA為模板，初步建立了褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱的多重PCR檢測技術，但具有耗時長，費用高等缺點；劉淑華等（2018年）以粗組織液為模板，建立了三種飛虱的直接多重PCR檢測技術，但需要凝膠電泳檢測環節，也具有耗時長、人為出錯率高的不足。因此，植保人員急需一種簡便，快速，易操作的鑒定方法。

熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程。Ct值(Cycle threshold，循環閾值)是指每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。Ct值與初始模板量存在一定負相關性，可用于初始模板量的計算。目前，熒光定量技術已被廣泛用于醫學與檢疫領域的物種鑒定，但對于褐飛虱及其近似種的鑒別，還沒有相關人員嘗試。另外，目前結合熒光定量PCR技術進行微生物和檢疫物種鑒定的方法或是以純DNA為模板，或是以探針法進行的，亦具有耗時長，耗費高的缺點。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種快速的基于Ct值的從多種近似種中鑒別褐飛虱的引物、試劑盒及方法的技術方案，該方法通過比較樣本與質控質粒Ct值的大小，即可判斷是否為褐飛虱。本發明不需DNA提取，用水研磨的粗組織液即可作為模板；本發明由于包含了質控質粒，是用定量的思路方法進行定性，對試劑及耗材的質量要求不高；本發明只需兩個溫度，30循環即可，1小時內便可得到結果。該特異性引物和試劑盒及建立的檢測方法具有靈敏、快速、高通量和簡單易操作等優點，可直接用于基層植保站對褐飛虱的快速鑒定，對節省人力物力和提高水稻重大害蟲褐飛虱的預測預報準確度具有極為重要的意義。