[發(fā)明專利]一種快速的基于Ct值的從多種近似種中鑒別褐飛虱的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910104550.0
• 申請日: 2019-02-01
• 公開（公告）號: CN109628615A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉淑華;唐健;周明好;楊保軍;王愛英;羅舉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 張曉紅

1. 一種用于鑒定褐飛虱的特異性引物對，其特征在于包括上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2. 一種用于鑒定褐飛虱的質(zhì)控重組質(zhì)粒，其特征在于其DNA序列如SEQ ID No.3所示。

3. 一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒，其特征在于包括：1）特異性引物對，上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；2）質(zhì)控重組質(zhì)粒，其DNA序列如SEQID No.3所示；3）PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液包含2×Reaction Buffer Mix、ddH₂O。

4. 如權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒，其特征在于反應(yīng)體系包括2×Reaction Buffer Mix 5μL，ddH₂O 2.8μL，濃度為10pmol/μL的上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1各0.1μL，濃度為20×10^-6ng/μL的質(zhì)控重組質(zhì)粒2μL或樣本粗組織液2μL。

5.如權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒，其特征在于質(zhì)控重組質(zhì)粒的使用濃度為4×10^-6ng/μL。

6.采用權(quán)利要求3所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）取待測飛虱單頭個體，用蒸餾水制備樣本粗組織液；

2）制備含上述2條特異引物的熒光定量PCR擴增體系，以質(zhì)控重組質(zhì)粒P作為臨界模板；

3）將上述PCR反應(yīng)液上機進行擴增；

4）結(jié)果分析。

7. 如權(quán)利要求6所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟1）中樣本粗組織液的具體制備方法為：取單頭待測樣本放入1.5ml離心管中，再加入500μLddH₂O研磨，手動研磨或自動研磨機研磨，自動研磨機的參數(shù)為5HZ，90s。

8. 如權(quán)利要求6所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟2）擴增體系中，各組分的具體比例為：2×Reaction Buffer Mix 5μL，ddH₂O 2.8μL，濃度為10pmol/μL的上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1各0.1μL，濃度為20×10^-6ng/L的質(zhì)控重組質(zhì)粒2μL或樣本粗組織液2μL，用ddH₂O補足10μL。

9. 如權(quán)利要求6所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟3）擴增條件中：具體為95℃、50 s，60℃、25s，共30個循環(huán)。

10.如權(quán)利要求6所述的一種用于鑒定褐飛虱的試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟4）結(jié)果分析中：根據(jù)Ct值的大小判斷，當樣本的Ct_S小于質(zhì)控質(zhì)粒P的Ct_P值時，則為褐飛虱，反之則不是褐飛虱。