[發明專利]一種構建RBM17基因敲除的間充質干細胞細胞系的方法

在審

• 申請號: 201910099337.5
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109777780A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 齊國光;魯南;馬立新
• 申請（專利權）人: 上海拉德鈁斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發明提供一種構建RBM17基因敲除的間充質干細胞細胞系的方法，包括以下步驟：(1)構建用于表達SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的質粒；(2)構建用于表達sgRNA的質粒；(3)將步驟(1)的質粒提前導入到間充質干細胞中，篩選得到陽性細胞后，再轉入步驟(2)的質粒。本發明篩選并優化獲得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在間充質干細胞中，構建了RBM17基因敲除的細胞系，基因編輯效率高，傳代穩定。

技術領域

本發明提供一種采用CRISPR-CAS系統針對間充質干細胞進行RBM17基因編輯的方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSC)，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質干細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應。由于間充質干細胞具備的這種免疫學特性，使其在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。

RNA結合基序蛋白17(RBM17)編碼一種RNA結合蛋白，該蛋白參與RNA剪接體復合物的構成，并且在mRNA剪接的第二催化步驟中發揮作用。RBM17包含一個非結構化N-末端結構域，一個G-補丁基序，以及一個mRNA剪接必需的C端的RNA識別基序。在人類中，RBM17在正常乳腺、肝、前列腺和胰腺的導管上皮中均有低表達，但是其在很多人類癌癥中均有過表達；現有技術中已經發現，通過抑制靶細胞中RBM17基因的表達，可進一步抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，可見，RBM17基因敲除在腫瘤治療中具有重要意義。

基于間充質干細胞的多能性，為了研究敲除RBM17基因的間充質干細胞在癌癥治療方面的功能，建立敲除RBM17基因的間充質干細胞細胞系變得尤為重要?，F有技術中，仍然存在基因編輯效率不夠高，不能穩定遺傳等問題。

發明內容

鑒以此，本發明提供一種構建RBM17基因敲除的間充質干細胞細胞系的方法，構建出一種敲除RBM17基因的間充質干細胞，克服了現有技術中基因編輯效率不夠高的技術缺陷。

本發明的技術方案是：

一種構建RBM17基因敲除的間充質干細胞細胞系的方法，包括以下步驟：

(1)構建用于表達SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的質粒；

(2)構建用于表達sgRNA的質粒；

(3)將步驟(1)的質粒提前導入到間充質干細胞中，篩選得到陽性細胞后，再轉入步驟(2)的質粒。

優選的，所述間充質干細胞為人骨髓間充質干細胞(hMSCs)PC015。

所述的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明篩選并優化獲得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在間充質干細胞中，構建了RBM17基因敲除的細胞系，基因編輯效率高，傳代穩定。

具體實施方式

為了更好理解本發明技術內容，下面提供具體實施例，對本發明做進一步的說明。

實施例1、CRISPR表達載體的構建

1.1sgRNA的設計

設計具體的sgRNA如下(SEQ ID NO:1～5)：

RBM17-sgRNA1:5'-ctcctcctcatgtctgcctc-3'