[發明專利]一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1

在審

• 申請號: 201910098244.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109706173A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 邵淑麗;張偉偉;張珍珠;朱少偉;杜洋
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 劉景祥

1.一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1，其特征在于：一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1，首先復蘇和培養A549/DDP細胞，接著根據NCBI中人NM號為001964.2的Egr1基因的mRNA序列，按照RNAi設計原則，設計最優靶向Egr1的干擾片段；正向序列和反向序列之間以序列為CGAA的Loop環連接，反向序列后連接終止序列TTTTTT；分析質粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位點，在5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上HindⅢ酶切位點，經NCBI Blast比對同源性確定與其他基因無同源性，送至上海生工合成，命名為shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空載質粒為無關序列作為對照組；shRNA的退火，使其形成雙鏈片段，構建靶向Egr 1的shRNA干擾表達載體，命名為pZSW-1；轉染A549/DDP細胞后，通過qRT-PCR檢測Egr1和MRP1基因mRNA的表達水平，通過Western blot檢測Egr 1和MRP1蛋白表達水平，用流式細胞儀檢測Rho-123藥物外排，結果顯示，干擾Egr1后，MRP 1基因表達降低，細胞內Rho-123熒光強度高于對照組2.23倍，MRP 1外排能力顯著下降；說明沉默Egr1基因，細胞對Rho-123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表達有助于逆轉肺癌細胞的耐藥性。

2.根據權利要求1所述的一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1，其特征在于：所述的復蘇和培養A549/DDP細胞的步驟為：細胞復蘇：液氮中取出凍存細胞，在37℃水浴鍋內搖晃，至其全部融化；緩慢滴入含5mL 1640培養基的離心管中，1000g離心5min，棄上清；用5mL 1640完全培養基懸浮細胞沉淀，移至細胞瓶，37℃、5％CO2培養箱內培養細胞；細胞傳代：棄原瓶內培養基，用5mL PBS輕輕洗滌細胞2遍；加入1mL0.25％胰酶消化細胞，鏡下觀察，待60％的貼壁細胞皺縮成亮點形態，加入完全培養基終止消化并反復吹打使其從壁上脫落；向細胞懸液中加入10mL完全培養基吹勻后，分別取出5mL加入兩個新瓶中，37℃、5％CO2培養箱內培養細胞；A549/DDP細胞復蘇和培養結果：細胞為貼壁生長，A549/DDP呈多邊形，細胞生長狀態良好。

3.根據權利要求1所述的一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1，其特征在于：所述的構建靶向Egr 1的shRNA干擾表達載體的步驟為：shEgr1片段的設計：根據NCBI中人Egr1基因mRNA序列，按照RNAi設計原則，設計最優靶向Egr1的干擾片段；正向序列和反向序列之間以序列為CGAA的Loop環連接，反向序列后連接終止序列TTTTTT；分析質粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位點，在5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上HindⅢ酶切位點，經NCBI Blast比對同源性確定與其他基因無同源性，送至上海生工合成，命名為shEgr1-3，shEgr1靶位點序列為GCGATGAACGCAAGAGGCATA，合成的oligo序列為：shEgr1-3-F：GATCCGCGATGAACGCAAGAGGCATACGAATATGCCTCTTGCGTTCATCGCTTTTTTGAATTCA；shEgr1-3-R：AGCTTGAATTCAAAAAAGCGATGAACGCAAGAGGCATATTCGTATGCCTCTTGCGTTCATCGCG；以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空載質粒為無關序列作為對照組；shRNA的退火：將合成的單鏈shEgr 1按照體系：F，2μL；R，2μL；10×PCRbuffer，5μL；dd H₂O，41μL，進行退火，使其形成雙鏈片段；各管混勻后94℃3min，37℃1h，使用時按照1:9的比例進行稀釋；shEgr1重組表達載體的構建：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP載體經Bam H I、HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測載體是否酶切完全，使用T₄DNA連接酶，按照表4連接體系進行連接；雙酶切回收后的線性與退火后的shEgr1片段的摩爾比為1：5，按照下列體系：pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP，1.0μL；T₄DNA，1.0μL；10×buffer，1.0μL；退火后的shEgr1片段，5.0μL；ddH₂O，2.0μL，連接酶進行連接，連接產物通過轉化實驗導入到大腸桿菌感受態細胞中，挑取單個菌落并進行富集培養，送至上海生工生物技術服務有限公司測序鑒定確認序列是否正確插入到pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP載體。