[發明專利]一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1

在審

• 申請號: 201910098244.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109706173A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 邵淑麗;張偉偉;張珍珠;朱少偉;杜洋
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 劉景祥

一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW?1，屬于基因工程技術領域，其特征在于：首先復蘇和培養A549/DDP細胞，接著設計最優靶向Egr1的干擾片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，構建靶向Egr 1的shRNA干擾表達載體，命名為pZSW?1，轉染A549/DDP細胞后，通過qRT?PCR、Western blot和流式細胞儀檢測，結果顯示，干擾Egr1后，MRP 1基因表達也隨之降低，轉染pZSW?1實驗組細胞內Rho?123熒光強度高于對照組2.23倍，差異顯著，MRP 1外排能力顯著下降；說明沉默Egr 1基因的表達有助于逆轉肺癌細胞的耐藥性。

技術領域

本發明涉及一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1，屬于基因工程技術領域。

背景技術

癌癥嚴重威脅著人類健康，癌細胞的產生是由于人體內原癌基因和抑癌基因受多種因素刺激，導致表達失衡，引起正常細胞的癌變。2018年國家癌癥中心數據顯示，肺癌是發病率和死亡率較高的腫瘤疾病之一，每年新發病例約為50萬例。藥物化療是治療腫瘤疾病常用的手段之一，但長時間的化療使肺癌細胞產生耐藥性，導致其治療效率降低(鄭佳彬，2017)。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種抗癌藥物產生耐藥性，同時對多種結構不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物產生的交叉耐藥現象，其作用機制復雜。研究表明，多藥耐藥相關蛋白1(MRP 1)基因的過表達是腫瘤細胞產生耐藥性的重要機制之一(Cole S P C，2014)。下調MRP 1蛋白表達，將有助提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，逆轉腫瘤細胞的耐藥現象。早期生長反應-1(early growth response,Egr 1)是一種重要的核轉錄因子(Karthikkeyan Gand Nagaraj N R，2018)，在調控細胞的生長、分化、發育、增殖等方面發揮著重要的作用。Egr 1基因在絕大多數的腫瘤細胞中均有表達，參與了從腫瘤形成、增殖分化到凋亡的全過程(林芳，2010)。Egr1是DNA結構域含有3個Cyc2-His2鋅指結構的轉錄因子(韓雷，2007)，在鋅離子存在的條件下，鋅指結構與DNA序列中富含GC區結合，發揮轉錄調控作用。因此，Egr1可作為轉錄因子調控諸多靶基因的表達。大量研究證實，Egr 1與靶基因上特異地結合位點作用調節細胞發揮各種生物學功能。腫瘤細胞中某些基因的突變可能促使Egr1表達升高，對于這些腫瘤細胞來說，Egr1基因的高表達與腫瘤的發生、發展有關，并可能起到促腫瘤的作用。因此如何發明一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1成為急需解決的一大難題，所以通過首先復蘇和培養A549/DDP細胞，接著根據NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi設計原則，設計最優靶向Egr1的干擾片段；正向序列和反向序列之間以序列為CGAA的Loop環連接，反向序列后連接終止序列TTTTTT；分析質粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位點，在5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上HindⅢ酶切位點，經NCBI Blast比對同源性確定與其他基因無同源性，送至上海生工合成，命名為shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空載質粒為無關序列作為對照組；shRNA的退火，使其形成雙鏈片段，構建靶向Egr 1的shRNA干擾表達載體，命名為pZSW-1。利用shRNA干擾表達載體轉染A549/DDP細胞，通過qRT-PCR檢測RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表達水平，通過Western blot檢測RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表達水平，用流式細胞儀檢測Rho-123藥物外排，發明一種通過RNAi沉默Egr1基因降低肺癌細胞多藥耐藥性的載體pZSW-1是必要的。

發明內容