[發(fā)明專利]一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌的構建方法及其產物和應用

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• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109628368A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設計）人: 李國強;馬挺;劉丹;高歌;吳萌萌
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

本發(fā)明提供了一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌的構建方法，其構建得到的工程菌株及應用，屬于生物技術和生物材料領域。本發(fā)明提供的構件方法先以Enterobacter sp.FY?07基因組為模板，擴增得到可拉酸基因簇原啟動子上游同源臂基因和下游同源臂基因；然后將上游同源臂基因、tac啟動子、下游同源臂基因融合，得到融合片段；再將融合片段插入骨架質粒，得到重組質粒；最后將重組質粒轉移至Enterobacter sp.FY?07菌株中，得到可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌。利用本發(fā)明所述基因工程生產菌合成的細菌纖維素具有明顯降低的結晶度、減弱的機械性能、均勻的三維網(wǎng)絡結構和顯著改善的持水率。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術和生物材料領域，具體涉及一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌的構建方法及其產物和應用。

背景技術

細菌纖維素(Bacterial Cellulose，簡稱BC)是由部分細菌產生的水不溶性胞外多糖聚合物，它是由D-吡喃葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接形成葡萄糖苷鏈直鏈。與自然界中存在的植物纖維素相比，細菌纖維素具有許多優(yōu)良特性，如高純度、高結晶度、高親水性、高抗張強度、生物相容性、生物可降解性等。這些性質使其廣泛應用于食品、造紙、石油開采、醫(yī)藥、化妝品、生物膜等領域。

目前生產細菌纖維素的模式菌株是Gluconacetobacter，該菌株是嚴格的好氧菌株，靜置發(fā)酵條件下，氧氣的濃度極大程度上影響最終纖維素的產量。雖然已經(jīng)采用通氣、攪拌、間歇型發(fā)酵罐等發(fā)酵方式來增加纖維素產量，但這也無疑增加生產成本，同時所產纖維素在性質上也存在著差異。與此同時，細菌纖維素也存在一些缺點，如結晶度太高、再水化能力差、官能團單一、可塑性較差、不易在水和一般有機、無機溶劑中溶解，致使纖維素成型、加工和應用均受到很大限制。

為了充分利用細菌纖維素的現(xiàn)有特性并賦予細菌纖維素新的特性，近年來關于細菌纖維素的改性研究越來越深入。有大量研究嘗試對細菌纖維素進行改性以改善其物理化學性質。細菌纖維素的改性方法有很多，包括化學表面修飾和原位改性。經(jīng)發(fā)酵獲得的纖維素膜經(jīng)過化學表面修飾，能夠賦予纖維素新的功能。然而，這種改性策略需要復雜的化學反應和大量的工作，存在工序繁瑣、成本昂貴等問題。原位改性一般是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加物質，使纖維素的結構和性能得到改性，無需復雜的后處理或較大的成本投入。但在發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加改性劑，存在以下問題：纖維素不能被適量的改性劑充分改性，而過量的改性劑會堵塞已充分改性纖維素的矩陣網(wǎng)格。如果在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量的改性劑，很難獲得均勻的改性纖維素，因為在發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素濃度逐漸增加，而改性劑的濃度卻穩(wěn)步下降。因此，與發(fā)酵前期產生的改性纖維素相比，發(fā)酵后期產生的纖維素由于改性劑的不足而難以得到充分的改性。相反，如果在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加過量的改性劑，發(fā)酵后期產生的纖維素也可以進行充分的改性，而殘留的改性劑則粘附在纖維素的纖維束和網(wǎng)絡上。

發(fā)明內容

鑒于背景技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌的構建方法、其構建得到的工程菌株及應用。

本發(fā)明提供了一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac的構建方法，包括如下步驟：

(1)以Enterobacter sp.FY-07基因組DNA為模板，擴增得到可拉酸基因簇原啟動子上游同源臂基因和下游同源臂基因；

(2)將上游同源臂基因、tac啟動子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；

(3)將所述融合片段插入骨架質粒，得到重組質粒；

(4)將所述重組質粒轉移至Enterobacter sp.FY-07菌株中，得到可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac。