[發明專利]一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌的構建方法及其產物和應用

在審

• 申請號: 201910096913.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109628368A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 李國強;馬挺;劉丹;高歌;吳萌萌
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)以Enterobacter sp.FY-07基因組DNA為模板，擴增得到可拉酸基因簇原啟動子上游同源臂基因和下游同源臂基因；

(2)將上游同源臂基因、tac啟動子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；

(3)將所述融合片段插入骨架質粒，得到重組質粒；

(4)將所述重組質粒轉移至Enterobacter sp.FY-07菌株中，得到可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中tac啟動子以pMMB66eh質粒為模板擴增獲得。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述tac啟動子的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(3)中骨架質粒為pTSK-1。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(4)中轉移的方法為接合轉移；所述接合轉移的供體細胞為E.coli S17。

7.權利要求1～6任意一項所述構建方法構建得到的可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac。

8.權利要求1～6任意一項所述構建方法或者權利要求7所述的可控結晶度細菌纖維素基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac在生產細菌纖維素中的應用。

9.一種可控結晶度細菌纖維素的生產方法，其特征在于，包括如下步驟：

①將權利要求7所述基因工程生產菌Enterobacter sp.FY-07::tac于LB培養基中活化，斜面富集培養，用無菌水沖洗斜面，得到菌懸液；

②將所述菌懸液按照0.5～3％的接種量接種于Li-Zhao培養基，25～35℃靜置發酵；所述Li-Zhao培養基包括如下重量百分比的組分：葡萄糖2～3％，KNO₃ 0.05～0.15％，Na₂HPO₄0.5～1.5％，MnCl₂ 0.01～0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.02～0.03％和NaSO₄ 0.03～0.035％；

③待所述發酵6～10h后，誘導培養24～72h，收獲細菌纖維素。

10.根據權利要求9所述的生產方法，其特征在于，所述LB培養基的pH值為7.2～7.4；所述LB培養基包括如下重量百分比的組分：蛋白胨0.5～2％，酵母粉0.2～0.8％和氯化鈉0.2～0.8％。