[發(fā)明專利]一種人NT-proBNP特異性重組羊單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910096758.2
• 申請(qǐng)日: 2019-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN109678958B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐淞;胡川閩;秦意力;范舒;普秀瓊;劉靜;艾海燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶探生科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/26
• 分類號(hào): C07K16/26;C12N15/13;G01N33/74;G01N33/577
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人腦鈉肽原N端肽(NT?proBNP)特異性的重組羊單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，所述人NT?proBNP特異性重組羊單克隆抗體包括羊單鏈抗體scFv和人IgG的Fc段；其中，所述羊單鏈抗體scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)重組抗體的低成本、高效率、高質(zhì)量的大量制備，且得到的抗體對(duì)人NT?proBNP具有高度的親和力，從而為制備更加質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的人NT?proBNP免疫檢測(cè)試劑盒奠定核心原料基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人腦鈉肽原N端肽(NT-proBNP)特異性的重組羊單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure,HF)作為嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病中的一種病理綜合癥，是心血管疾病發(fā)展到后期的一個(gè)階段，即從始發(fā)危險(xiǎn)因子(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病等)到左心室肥大、心肌細(xì)胞功能紊亂、冠心病，最后發(fā)展成為心力衰竭。由于我國(guó)冠心病和高血壓發(fā)病仍呈上升趨勢(shì)，人口老齡化趨勢(shì)明顯，心力衰竭正成為我國(guó)心血管領(lǐng)域的重要公共健康問題，其早期診斷和早期治療極為重要。

目前認(rèn)為，腦鈉肽(BNP)和腦鈉肽原N端肽(NT-proBNP)是心力衰竭的最佳生物標(biāo)志物。BNP是32個(gè)氨基酸的多肽，是從前體蛋白腦鈉肽原(pro-BNP)的羧基端裂解而來，同時(shí)產(chǎn)生76個(gè)氨基酸非活性的N末端腦鈉尿肽原(NT-proBNP)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明血漿BNP和NT-pro BNP濃度的升高對(duì)于心衰的診斷具有很高敏感性，可作為心力衰竭診斷的敏感指標(biāo)，并能評(píng)估心功能損害嚴(yán)重程度。NT-proBNP和BNP為等摩爾釋放，因此二者在心血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后方面有著相似的臨床應(yīng)用。但與BNP相比，NT-proBNP因其半衰期長(zhǎng)(半衰期為120min)、心衰時(shí)升高幅度大而更有利于臨床應(yīng)用。早在2002年，國(guó)際上已經(jīng)公認(rèn)NT-proBNP是測(cè)定心衰的一個(gè)劃時(shí)代的具有特異性的標(biāo)志物。迄今，NT-proBNP的檢測(cè)廣泛應(yīng)用于心力衰竭的診斷、鑒別診斷、療效觀察和預(yù)后判斷。

目前檢測(cè)樣本中的NT-proBNP均采用免疫學(xué)方法，即通過特異性的抗體與樣本中NT-proBNP結(jié)合才進(jìn)行檢測(cè)，包括固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金免疫層析、熒光免疫層析、免疫化學(xué)發(fā)光分析等。所有這些分析方法都會(huì)用到NT-proBNP特異性抗體。早期曾應(yīng)用來源于小鼠、羊的多克隆抗體，后來更多應(yīng)用小鼠單克隆抗體，也有應(yīng)用兔單克隆抗體的情況。小鼠來源的NT-proBNP特異性單克隆抗體是目前NT-proBNP檢測(cè)試劑中應(yīng)用最為廣泛的抗體。

相比多克隆抗體，單克隆抗體在特異性、穩(wěn)定性等性能參數(shù)上有明顯的提升，也就導(dǎo)致了相應(yīng)的免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能有了很大程度的保障，能廣泛應(yīng)用于臨床。但是在單克隆抗體的制備過程中，存在雜交瘤篩選比較復(fù)雜、雜交瘤細(xì)胞保存成本較高、需要喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠等情況。目前應(yīng)用較多的小鼠腹水誘生法制備單克隆抗體存在不同程度的批間差異，從而給產(chǎn)品的質(zhì)量控制帶來更大的工作量。就此而言，基于基因工程技術(shù)制備的重組抗體相比于傳統(tǒng)的單克隆抗體更具優(yōu)勢(shì)，一旦獲得相應(yīng)的氨基酸編碼序列和表達(dá)質(zhì)粒，就可以通過原核生物或真核生物進(jìn)行大批量生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)抗體的低成本、高效率、高質(zhì)量的大量制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人NT-proBNP特異性單克隆抗體的低成本、高效率、高質(zhì)量的大量制備，從而提供人NT-proBNP特異性重組羊單克隆抗體及其應(yīng)用。

目前，羊多克隆抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、臨床檢測(cè)和臨床治療等諸多方面。且研究發(fā)現(xiàn)，羊的免疫系統(tǒng)與人、鼠等的免疫系統(tǒng)存在一定程度的差異，其本身具有更大的產(chǎn)生高親和力抗體的潛力。有實(shí)驗(yàn)表明，基于羊的B淋巴細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞建立的異源雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的羊單克隆抗體具有很高的親和力。本發(fā)明的人NT-proBNP特異性重組羊單克隆抗體正是基于羊來源的重組抗體，其既能解決傳統(tǒng)單克隆抗體的諸多不足，又能夠制備高親和力抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度靶標(biāo)的低成本、高效益準(zhǔn)確測(cè)定。